Next-Generation-Sequenzierung – Next-Generation-Qualität in der Pädiatrie

Monogene Erkrankungen sind Erkrankungen, die durch pathogene Varianten (Mutationen) in einem einzelnen Gen verursacht werden. Einige Beispiele sind in Tab. 1 aufgeführt. Es sind seltene Erkrankungen (Inzidenz <1:2000), betreffen in ihrer Gesamtheit aber viele pädiatrische Patienten. Außerdem sind sie die häufigste Ursache für Todesfälle im 1. Lebensjahr.

Für die WES werden etwa 3–5 ml EDTA-Blut (bei Säuglingen genügen 2 ml) zur DNA-Extraktion aus Leukozyten benötigt. Die proteinkodierenden, exonischen DNA-Abschnitte werden zunächst angereichert und in der Folge mehrfach parallel sequenziert. Danach werden die erhaltenen Sequenzdaten mit einer Referenzsequenz verglichen. Abweichungen von der Referenzsequenz werden als Varianten bezeichnet. Im Mittel finden sich bei jedem Menschen etwa 30.000 Varianten. Die Mehrzahl dieser Varianten ist nicht krankheitsrelevant und es bedarf mehrerer Filterschritte, um die pathogene(n) Variante(n) für eine monogene Erkrankung zu identifizieren.

WES-Daten werden in allen Laboren nach ähnlichen Algorithmen ausgewertet. Die Datenfilterung beruht dabei auf zwei Grundannahmen:

Die öffentlich zugänglichen Datenbanken Exome Aggregation Consortium (ExAC; exac.broadinstitute.org) und Genome Aggregation Database (gnomAD; gnomad.broadinstitute.org) beinhalten Exom- bzw. Genomsequenzierungsdatensätze von aktuell etwa 130.000 gesunden Kontrollpersonen. Diese Daten sind zusammen mit der eigenen Sequenzdatenbank essenziell für die Varianteninterpretation.

Die frei zugängliche Datenbank Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM; www.​omim.​org) listet momentan (Stand 07. April 2018) 5218 Krankheitsbilder auf, für die eine molekulargenetische Basis als bekannt angenommen werden kann. Mutationen in 3941 verschiedenen Genen, also etwa einem Fünftel der bekannten Gene des Menschen, sind ursächlich für diese Krankheiten.

Die klinische WES-Analyse beschränkt sich auf die Suche nach potenziell krankheitsverursachenden Varianten in Genen, die in OMIM gelistet werden (Krankheitsgene). Ist eine beim Patienten gefundene Variante hier als krankheitsauslösend beschrieben, wird sie als pathogen eingestuft und berichtet. Finden sich unbekannte Varianten in einem Gen, helfen Softwareprogramme bei der Einschätzung der Pathogenität. Die Variante kann als wahrscheinlich pathogen oder als Variante unklarer Signifikanz (VUS) berichtet werden. Hierbei wiegt selbstverständlich stark, ob der klinische Phänotyp des Patienten mit den in der Fachliteratur beschriebenen Krankheitssymptomen übereinstimmt. Dies unterstreicht die Wichtigkeit einer guten klinischen Phänotypisierung (und die Mitteilung dieser Information an das WES-Auswerte-Team). Ebenso wichtig ist die Stammbaumerhebung/Familienanamnese, da für die verschiedenen Krankheitsgene unterschiedliche Erbgänge typisch sind (autosomal dominant, autosomal rezessiv, X‑gebunden, mitochondrial).

Finden sich in den OMIM-Genen keine bekannten Varianten, kann die Analyse auf alle menschlichen Gene ausgedehnt werden, jedoch handelt es sich dann im strengen Sinn nicht mehr um eine klinische WES-Analyse, sondern um eine Untersuchung mit gewissem Forschungscharakter. Varianten, die hierbei als potenziell krankheitsverursachend eingeschätzt werden, bedürfen idealerweise funktioneller Bestätigung (biochemische Untersuchungen z. B. in kultivierten Hautfibroblasten) oder zumindest des Nachweises über denselben Phänotyp in mehreren Patienten. So kann dann eine neue Gen-Krankheits-Assoziation hergestellt werden.

Generell ermöglichen die für die Exomsequenzierung generierten Daten auch eine gezielte Auswertung bezüglich „copy number variation“ (CNV), z. B. Deletionen, und Varianten in der mitochondrialen DNA. Dies ist aber abhängig von der Erfahrung des ausführenden Labors, gegebenenfalls empfiehlt sich die zusätzliche Durchführung eines konventionellen Arrays.

Idealerweise sollten nicht nur die Sequenzdaten des Kinds vorliegen, sondern auch eine Analyse als Eltern-Kind-Trio (TRIO-WES) erfolgen. Diese Analyse ist insbesondere wichtig bei genetischen Erkrankungen, die nicht vererbet werden, sondern de novo entstanden sind (häufig z. B. bei Epilepsie, Entwicklungsverzögerung oder Intelligenzminderung). Generell ist eine Trio-WES leichter auszuwerten, da die elterlichen Daten als Vergleich vorliegen und sofort nachvollziehbar ist, ob z. B. bei rezessiven Erkrankungen 2 Varianten beim Kind auch tatsächlich biallelisch vorliegen. Dieser Zeitaspekt sollte insbesondere bei kritisch kranken Kindern berücksichtigt werden.

Mit den oben genannten Schritten und in der interdisziplinären Zusammenschau von Klinik/Phänotyp und der Möglichkeit funktioneller biochemischer Diagnostik gelingt es, je nach Indikation, in bis zu 50 % aller Fälle eine genetische Diagnose zu stellen (Abb. 1).

Dass eine Diagnosestellung nicht immer gelingt, kann verschiedene Gründe haben:

Die Auswertung der WES-Daten ist abhängig von der Qualität der vorangegangenen Phänotypisierung, allerdings kann die Exomsequenzierung bei sehr unspezifischen klinischen Symptomen wie globale Entwicklungsverzögerung auch zu Befunden führen, die eine nachgeordnete Phänotypisierung erfordern („reverse phenotyping“). Eine sorgfältige Erhebung der Anamnese, der Familienanamnese inklusive eines Stammbaums über drei Generationen sowie eine ausführliche klinisch-neurologische Untersuchung sind selbstverständlich vorher durchzuführen. Der anfordernde Arzt muss danach gut abwägen, welche (invasiven) Untersuchungen vor einer Exomsequenzierung gerechtfertigt sind, da sie entweder für eine Behandlungsentscheidung essenziell sind oder bei der Auswertung der Exomsequenzierungsdaten helfen könnten. Unzählige ungerichtete Screeninguntersuchungen können so vermieden werden und wiegen die (relativ) hohen Kosten der WES auf, wie mehrere Studien gezeigt haben. Aufgrund der fehlenden Detektionsmöglichkeit des Fragilen-X-Syndroms sollte diese Untersuchung ergänzt werden. Ebenso sollte die CNV-Analyse mithilfe von Arrays aus oben geschilderten Gründen gegebenenfalls ergänzt werden. Somit wird immer deutlicher, dass die neuen genetischen Untersuchungsmethoden, wenn sie gezielt eingesetzt werden, eigentlich ökonomisch von klarem Vorteil sind. Das wird auch zunehmend von den Krankenkassen so gesehen. Zudem ist eine zu breite und unkritische Anwendung von WES durch die Etablierung und Filterfunktion der Medizinisch-genetischen Zentren in Österreich eher unterbunden. Pragmatischerweise erscheint also ein Genetics-first-Ansatz medizinisch und ökonomisch gerechtfertigt.

Die Exomsequenzierung an sich und die gefundenen seltenen Erkrankungen erfordern ein enormes Detailwissen, das eine meist internationale Teamarbeit über die Spezialisierungsgrenzen hinaus erfordert.

Wie bei der Durchführung aller Untersuchungen, sollte auch eine WES immer als Ziel haben, dass das Untersuchungsergebnis eine für den Patienten bzw. dessen Eltern relevante Information beinhaltet oder für die Behandlung entscheidend ist. Und genau hier liegt sowohl die Herausforderung, als auch die Chance. Die Abb. 1 zeigt, wie eine holistische Betreuung von Kindern (z. B. mit Entwicklungsverzögerung) mit seltenen Erkrankungen an einem Kinderzentrum aussehen könnte.

Die Hauptaufgabe des Kinderzentrums ist es, so schnell wie möglich und mit so wenigen (invasiven) Untersuchungen wie möglich eine fundierte Diagnose zu stellen und die Betreuung bzw. Behandlung des Patienten zu koordinieren. Jeder, der mit der Betreuung dieser Kinder beschäftigt ist, weiß, dass die Patienten häufig eine lange Odyssee mit vielen Arztbesuchen und Untersuchungen hinter sich haben, bevor eine Diagnose gestellt wird. Ein Kind mit Entwicklungsverzögerung wird manchmal zuerst dem Neuropädiater, manchmal dem Humangenetiker und manchmal dem Spezialisten für angeborene Stoffwechselerkrankungen vorgestellt. Immer wieder stellen sich solche Patienten auch in der Akutambulanz mit einer Einweisung zur stationären Abklärung vor.

Um die Zeit optimal zu nutzen und die Anzahl der Arztkontakte bzw. Untersuchungen (und somit auch Kosten) zu minimieren, empfehlen wir, alle Kinder in einer gemeinsamen Sprechstunde bzw. im Rahmen einer tagesstationären Aufnahme der genannten Disziplinen zu sehen. Wie in Abb. 1 gezeigt, können dann auch zeitnah ergänzende Untersuchungen durchgeführt werden, insbesondere, wenn sie eine Behandlungsrelevanz haben. Genauso ist hier die Abklärung von Hör- bzw. Sehverlust zu erwähnen, da sich hierbei in der Regel Behandlungsmöglichkeiten bieten. Weiterhin sollte ein fallführender Arzt benannt werden, der während des diagnostischen Prozesses die Koordination übernimmt und Ansprechpartner für Zuweiser und die Eltern ist. Wird innerhalb dieser Abklärung eine Diagnose erzielt, sollte festgelegt werden, welcher Arzt bzw. welche Fachrichtung die weitere Betreuung des Patienten übernimmt und in der weiteren Folge sollte ein gemeinsames pädiatrisch-genetisches Diagnosegespräch stattfinden. Der fallführende Arzt hat nun vielfältige Aufgaben: Literaturrecherche, Information des zuweisenden Kinderfacharztes oder Hausarztes, Information der Eltern, falls gewünscht auch Herstellen eines Kontakts zu anderen Patienten, Überweisung an ein auf die gefundene Erkrankung spezialisiertes Kinderzentrum, Evaluation gezielter Therapiemöglichkeiten (Abb. 2), z. B. im Rahmen von Studien.

Patienten, bei denen keine Diagnose gestellt wurde, sollten in 1‑ oder 2‑jährlichem Abstand erneut vorgestellt werden.

Die Bündelung des Wissens und die standardisierte Patientenversorgung erlauben es, auch Patienten mit seltenen Erkrankungen gemäß „evidence-based best practice“ zu behandeln und eröffnet somit eine Next-Generation-Qualität in der Kinder- und Jugendheilkunde.