Einfluss von Vitalfarbstoffen auf die Funktion der äußeren Blut-Retina-Schranke in vitro

 

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Zusammenfassung

Hintergrund: Die Verwendung von Vitalfarbstoffen im Rahmen der „Chromovitrektomie” erleichtert die Entfernung von schwer erkennbaren Strukturen wie epiretinalen Membranen (EM) oder der Membrana limitans interna (ILM). In den letzten Jahren wurde diesbezüglich in zahlreichen Studien die Anwendung von Indozyanin Grün (ICG), Trypan Blau (TB) und Patent Blau (PB) beschrieben. Berichte über eine mögliche Toxizität dieser Farbstoffe, im speziellen von ICG, hinsichtlich reduzierter Visusergebnisse, möglicher Gesichtsfeldausfälle oder Alterationen des retinalen Pigmentepithels (RPE) machen weitere experimentelle Untersuchungen der Effekte dieser Substanzen insbesondere unter In-vitro-Bedingungen notwendig. Material und Methode: Humane RPE-Zellen und Endothelzellen der Aderhaut wurden in Monolayern auf semipermeablen Membranen gezüchtet und somit ein In-vitro-Modell der äußeren Blut-Retina-Schranke etabliert. Mittels Messung des transepithelialen elektrischen Widerstands (TER) erfolgte die Bestimmung der Barrierefunktion. Zwei unterschiedliche Modelle, welche ein mit Flüssigkeit und ein mit Luft gefülltes Auges darstellten, wurden getestet, einerseits mittels Zugabe des Farbstoffes zum Medium und andererseits durch direkte Applikation auf den Zell-Monolayer. An diesen zwei unterschiedlichen Modellen wurden für drei Minuten ICG (5 mg/ml, 0,5 mg/ml, 0,125 mg/ml), TB (1,5 mg/ml, 0,15 mg/ml) und PB (2,4 mg/ml, 0,24 mg/ml) appliziert und deren Einfluss auf die Barrierefunktion gemessen. Das RPE-Zellwachstum wurde ebenfalls in diesen zwei Modellen nach der Applikation von ICG, TB und PB getestet. Abschließend erfolgte die Untersuchung der RPE-Monolayer mittels Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM). Ergebnisse: Nach Applikation von TB, PB und der niedrigsten Konzentration von ICG von 0,125 mg/ml zu den beiden Modellen blieb die TER stabil. Im Gegensatz dazu verursachte ICG in den Konzentrationen von 5 mg/ml und 0,5 mg/ml eine signifikante Reduktion der TER am Modell des mit Luft gefüllten Auges, während keine Beeinflussung der Funktion der äußeren Blut-Retina-Schranke am Modell des mit Flüssigkeit gefüllten Auges festgestellt werden konnte. Die Wachstumsraten der RPE Zellen wurden durch Zusatz der Vitalfarbstoffe nicht beeinflusst - mit Ausnahme von ICG in der Konzentration von 5 mg/ml im Modell des mit Luft gefüllten Auges, wo es zu einer vorübergehenden Reduktion der Zellzahl kam. Dementsprechend zeigten sich auch in der TEM nach 3-minütiger Applikation von 5 mg/ml ICG am mit Luft gefüllten Auge interzelluläre Vakuolen. Eine Schädigung der RPE-Zellen selbst konnte hingegen nicht nachgewiesen werden. Keine pathologischen Veränderungen in der TEM wurden nach Applikation von TB und PB gesehen. Schlussfolgerungen: Die Anwendung von PB und TB am hinteren Augenpol scheint hinsichtlich Schäden am RPE und dessen Barrierefunktion sicher zu sein. ICG hingegen kann bei höheren Konzentrationen und längerer Anwendungsdauer toxische Effekte auf Morphologie und Funktion von RPE Zellen haben.

Abstract

Background: The use of vital dyes in “chromovitrectomy” allows the easier removal of less recognizable structures like epiretinal membranes (EM) or the inner limiting membrane (ILM). In recent years numerous studies demonstrated the use of indocyanine green (ICG), trypan blue (TB) and patent blue (PB) for this indication. Reports of the possible risk of these dyes, i. e. especially ICG, in respect of reduced visual acuity results, possible visual field defects or alterations of the retinal pigment epithelium (RPE) resulted in limitations in their application. Material and Methods: Human RPE cells and choroidal endothelial cells were cultured in monolayers on semipermeable membranes representing an in vitro model of the outer blood-retinal barrier. By measurement of the transepithelial electrical resistance (TER) the stable barrier function was determined. Two different models representing an air-filled and a fluid-filled eye were tested on the one hand by addition of the dye to the culture medium and, on the other, by direct application on the cell monolayer. In these two models ICG (5 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.125 mg/ml), TB (1.5 mg/ml, 0.15 mg/ml) and PB (2.4 mg/ml, 0.24 mg/ml) were applied for three minutes and the influence on the barrier function was determined. RPE cell growth was also tested in these two models after the application of ICG, TB and PB. Finally, monolayers of RPE cells were evaluated by transmission electron microscopy (TEM). Results: After application of TB, PB and the lowest concentration of ICG of 0.125 mg/ml, the TER remained stable in both models. In contrast, ICG in a concentration of 5 mg/ml and 0.5 mg/ml caused a significant TER decrease in the model of the air-filled eye, whereas no influence on the function of the outer blood-retinal barrier was noted in the model of the fluid-filled eye. RPE cell growth rates were not influenced by the addition of the vital dyes, with the exception of ICG in a concentration of 5 mg/ml in the model of the air-filled eye, resulting in a temporary reduction of the cell count. In good correspondence to these results also in TEM intercellular blisters were noted after application of 5 mg/mL ICG for 3 minutes in the model of the air-filled eye. However, damage to the RPE cells themselves was not obvious. No pathological changes in the TEM were noted after application of TB and PB. Conclusions: The use of PB and TB at the posterior eye segment seems to be safe concerning damage to the PRE and its barrier function. In contrast, ICG in higher concentrations and with longer application times may cause a toxic effect on RPE morphology and function.

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Dr. Stefan Mennel

Klinik für Augenheilkunde, Philipps-Universität Marburg

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