Immunfluoreszenzuntersuchungen in der Dermatologie

Unter Immunfluoreszenz versteht man die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Antikörpern zur Detektion von Zielantigenen. Als Fluorochrom wird meistens FITC (Fluoresceinisothiocyanat) angewendet, das nach Anregung mit blauem Licht (Absorptionsmaximum bei 495 nm) im grünen Farbspektrum (Emissionsmaximum bei 519 nm) emittiert.

Bei der direkten Immunfluoreszenz (DIF) werden gewebsgebundene Antigene (in einer Hautprobe) detektiert (Abb. 1a). Etabliert hat sich in der Routinediagnostik der Einsatz von Antikörpern gegen humanes IgG, IgM, IgA, den Komplementfaktor C3 sowie gegen Fibrinogen. Bei der indirekten Immunfluoreszenz (IIF) werden im Serum zirkulierende Autoantikörper gesucht. Dafür werden verschiedene Substrate in Form von z. B. Gewebeschnitten verwendet, die diese Autoantikörper gut binden können, d. h. das Zielantigen dieser Autoantikörper in hohem Maße exprimieren. Häufig verwendet werden Affenösophagus, Meerschweinchenösophagus, Rattenharnblase sowie humane Haut oder auch mit einem bestimmten Zielantigen transfizierte Zelllinien. Nach Verdünnung des Patientenserums wird dieses mit dem Substrat inkubiert und etwaige gebundene Autoantikörper in einem zweiten Schritt mit einem FITC-markierten antihumanen IgG- oder auch IgA-Antikörper markiert (Abb. 1b).

Ergänzt wird die indirekte Immunfluoreszenz häufig durch weitere Methoden zum Nachweis von Autoantikörpern, wie z. B. einem ELISA oder Western Blot.

Die Wahl einer geeigneten Biopsiestelle für die DIF ist ein wesentlicher Faktor für den Erfolg der Untersuchung [3, 4]. Bei AIBD (autoimmun-blasenbildenden Dermatosen) liegt diese periläsional in gesund erscheinender Haut, bis zu 1 cm neben einer vorhandenen Blase, da es im Bereich der Blase aufgrund des inflammatorischen Milieus durch Proteasen von Leukozyten zu einem Abbau der Antikörperablagerungen und somit zu falsch-negativen Befunden kommen kann. Zudem riskiert eine läsionale Biopsie das Abschwimmen und somit den Verlust des Blasendaches, was eine Beurteilung ebenfalls unmöglich macht. Bei allen anderen Indikationen sollte die Hautprobe läsional aus einer möglichst rezenten Veränderung entnommen werden. Für einen Lupusbandtest hingegen wird gesunde Haut an einer nicht-UV-exponierten Stelle, z. B. gluteal, entnommen.

Die Hautprobe muss für den Nachweis der gewebsgebundenen Autoantikörper bzw. einer Komplementaktivierung nativ (in 0,9 % Kochsalzlösung oder einem Zellkulturmedium) ins Labor gebracht werden. Falls dies nicht innerhalb von 24–48 h möglich sein sollte, kann ein spezielles Transportmedium (Michel’s Medium, eine gepufferte Ammoniumsulfatlösung) verwendet werden, das eine Stabilisierung von Antigen-Antikörperkomplexen im Gewebe für bis zu fünf Tage ermöglicht [5]. Alternativ könnte die Probe auch sofort eingefroren transportiert werden, eine im Alltag allerdings oft unpraktische Lösung. Eine akzidentelle Fixierung in herkömmlichen Formaldehydlösungen würde aufgrund der Kreuzvernetzung von Proteinen zu einem Verlust von Epitopen und damit der Reaktivität innerhalb von Minuten führen [6].

Üblicherweise werden 5‑µM-Gefrierschnitte von der Biopsie angefertigt und mit einer definierten Anzahl an Fluorochrom-markierten Antikörpern gefärbt. Dabei haben sich Antikörper zum Nachweis von IgG, IgA, IgM, Komplementfaktor C3 und Fibrinogen (F) als Standard etabliert [7, 8].

Beurteilt werden der Ort der Ablagerungen, die Art der Ablagerungen (welches Immunglobulin, Komplement, F), die Intensität der Färbung und damit extrapoliert die Zahl der Ablagerungen und das Muster. Exkludiert werden unspezifische Färbungen sowie Autofluoreszenz des Gewebes. Das Ergebnis der DIF-Untersuchung sollte immer in Zusammenschau mit dem klinischen Bild sowie der histopathologischen Untersuchung betrachtet werden. Gegebenenfalls können serologische Methoden wie die IIF die Untersuchung unterstützen [9].

Erkrankungen der Pemphigusgruppe sind durch das Auftreten von Autoantikörpern gegen desmosomale Adhäsionsproteine von Keratinozyten gekennzeichnet (Tab. 1; [4, 10]). Durch den Verlust dieser Zell-Zell-Kontakte kommt es zu einer intraepidermalen Spaltbildung in Haut und hautnahen Schleimhäuten, die Art der Erkrankung wird dabei wesentlich durch das Zielantigen mitbestimmt. Beim Pemphigus vulgaris sind dies Desmoglein 3 (DSG3), beim mukokutanen Pemphigus Dsg3 und Desmoglein 1 (DSG1), beim Pemphigus foliaceus nur DSG1. Gewebegebundene Autoantikörper lassen sich in der DIF, abhängig im Wesentlichen nur von der korrekten Biopsieentnahme, in nahezu 100 % aller Fälle nachweisen, dadurch stellt sie den Goldstandard in der Diagnose dar.

Gemäß der Verteilung der Antigene führt dies in der DIF zu einer Anfärbung der Zellmembranen der Keratinozyten, dem sogenannten Interzellularmuster („intercellular space“, ICS-Muster). Nachdem DSG3 vor allem in den basalen Keratinozyten, DSG1 hingegen in höheren Lagen der Epidermis exprimiert wird, kann diese Verteilung in manchen Fällen auch in der DIF beobachtet werden (Abb. 2). Alleine aus der DIF lässt sich die Diagnose des Subtyps des Pemphigus allerdings nicht verlässlich stellen. Hierfür sind serologische Untersuchungen unerlässlich, wobei als Substrat für die IIF insbesondere Affen- und Meerschweinchenösophagus verwendet werden. Sowohl DSG1- als auch DSG3-Autoantikörper können auch verlässlich mittels ELISA nachgewiesen werden, wobei die Titer mit der Krankheitsaktivität korrelieren.

Der Pemphigus erythematosus als lokalisierte Variante des Pemphigus foliaceus tritt bevorzugt im Gesicht und Dekolleteebereich auf. Hier wurden in der DIF neben dem ICS-Muster zusätzlich granuläre Ablagerungen von IgG und C3 an der Basalmembranzone (BMZ), wie sie auch beim Lupus erythematodes vorkommen, beschrieben, wobei dies aber nur bei einem kleinen Teil der Patienten tatsächlich der Fall ist.

Der IgA-Pemphigus ist durch Autoantikörper vom IgA-Subtyp gegen ein weiteres desmosomales Adhäsionsprotein, Desmocollin 1 (DSC1), gekennzeichnet. Bei der subkorneal-pustulösen Variante finden sich diese Ablagerungen in der DIF nur in den oberflächlichen Epidermisschichten (Abb. 3), bei der intraepidermalen neutrophilen IgA-Dermatose im Bereich der gesamten Epidermis. Aufgrund des IgA-Isotyps sind diese Autoantikörper mithilfe bisher erhältlicher, routinemäßig durchgeführter ELISA, die ausschließlich IgG-Antikörper detektieren, nicht nachweisbar. Die IIF am Affenösophagus ist in nur ca. 50 % aller Fälle positiv. Die DIF bleibt hier die verlässlichste Nachweismethode.

Eine Sonderstellung nimmt auch der paraneoplastische Pemphigus (PNP) ein. Bei ihm lassen sich Autoantikörper gegen eine Vielzahl von epidermalen Strukturproteinen nachweisen, insbesondere auch gegen Plakine, die diagnostisch wegweisend sind und sich gut in der IIF an der Rattenharnblase (die besonders reich an Plakinen ist; Abb. 4) oder einem ELISA nachweisen. Nachdem auch Autoantikörper gegen hemidesmosomale Proteine (BP230) auftreten, kann in der DIF nicht nur ein ICS-Muster, sondern auch ein lineares Muster mit IgG und C3 an der BMZ positiv sein. In bis zu 50 % aller Fälle kann die DIF beim PNP aber negativ sein.

Allen Pemphigoiderkrankungen gemeinsam ist das Auftreten von Autoantikörpern gegen hemidesmosomale Proteine, die die Keratinozyten mit ihrer Basalmembran verbinden (Tab. 2; [4, 11]). Entsprechend ähnlich ist das Muster der Ablagerungen in der DIF: praktisch immer zeigen sich IgG und C3 linear an der BMZ (Abb. 5). Der positive prädiktive Wert der DIF ist nahezu 100 %, der negative prädiktive Wert liegt bei ca. 90 %, aufgrund von z. B. inkorrekt durchgeführten Biopsien. Damit ist die DIF auch bei den Pemphigoiderkrankungen der Goldstandard der Diagnose.

Eine weitere Differenzierung der Subtypen lässt sich einerseits anhand des Musters des linearen Signals, andererseits anhand eventuell vorhandener zusätzlicher Ablagerungen treffen. Verlässlich ist dies aber vor allem durch Bestimmung der im Serum zirkulierenden Autoantikörper mittels IIF und ELISA möglich.

Bei stärkerer Vergrößerung (600 ×) kann das lineare Signal an der BMZ zwei verschieden gewellte Muster aufweisen: Beim n‑Muster sind die Wellen oben geschlossen, beim u‑Muster nach oben offen. Das u‑Muster findet sich nur bei Vorhandensein von Antikörpern gegen Kollagen Typ VII, d. h. bei der Epidermolysis bullosa acquisita (EBA), dem bullösen Lupus erythematodes und manchmal beim vernarbenden Pemphigoid, bei allen anderen Erkrankungen zeigt sich ein n‑Muster [12].

Beim Lichen planus pemphigoides können zusätzliche Merkmale des Lichen planus vorhanden sein, insbesondere ein bandförmiges Fibrinogen an der BMZ. Beim bullösen LE können gleichzeitig Charakteristika des LE in der DIF sichtbar sein, vor allem granulär-bandförmige Ablagerungen von IgM und C3 entlang der Junktionszone. Beim Pemphigoid gestationis (PG) kann das lineare IgG-Signal sehr schwach sein oder fehlen, C3 ist aber stets deutlich positiv. Man führt dies auf niedere Titer einerseits, andererseits auf die gute Komplementfixierung der Autoantikörper zurück. Bei der linearen IgA-Dermatose findet sich überwiegend IgA an der BMZ; dies kann auch beim Schleimhautmemphigoid („mucous membrane pemphigoid“, MMP) oder der EBA der Fall sein.

Die IIF am Affenösophagus ist bei Pemphigoiderkrankungen nicht so sensitiv wie bei Pemphiguserkrankungen, vor allem aufgrund von Unterschieden zwischen dem BP180-Protein bei Affen und Menschen. Anti-BP230-Autoantikörper hingegen können am Affenösophagus gut detektiert werden, korrelieren aber nicht mit der Krankheitsaktivität. Zusätzlich erlauben weder die IIF am Affenösophagus noch auf normaler humaner Haut eine weitere Differenzierung zwischen Pemphigoid Subtypen. Diese ist aber durch die Salt-split-skin(SSS)-Untersuchung möglich. Durch Inkubation einer gesunden humanen Hautprobe mit 1M-NaCl-Lösung wird ein artifizieller Spalt in der Lamina lucida der Basalmembran induziert. BP180, BP230 und α6β4 Integrin finden sich am Blasendach des Spaltes, während Kollagen VII, Laminin 332 und Laminin γ1 am Blasenboden bleiben. Eine IIF mit Patientenserum auf diesem Substrat erlaubt daher eine grobe weitere Einteilung der Pemphigoide (Abb. 6). Zusätzlich können Autoantikörper gegen rekombinante Fragmente von BP180, BP230 und Kollagen VII mittels ELISA gemessen werden. Hierbei ist zu beachten, dass die derzeit kommerziell erhältlichen BP180-ELISA-Systeme nur Antikörper gegen die immundominante Domäne NC16A des BP180-Proteins detektieren können.

Ein mittlerweile aufgrund der Verfügbarkeit von ELISA seltener durchgeführter Test ist der Komplementbindungstest (auch Herpes gestationis [HG‑] Test) zur Abklärung eines Pemphigoid gestationis. Eine herkömmliche IIF an der SSS ist beim PG oft negativ bzw. nur schwach positiv. Man macht sich die gute Komplementfixierung der gebundenen Autoantikörper zunutze und amplifiziert das Signal einer IIF an der SSS durch Zusetzen von Komplement und einer anschließenden Detektion mittels anti-C3c-FITC-markierten Antikörpern. Auf diese Weise lässt sich die Sensitivität der IIF beim PG auf 90 % steigern.

Die Diagnose eines MMP kann sich schwieriger gestalten, da die DIF bei rein okulärem Befall in bis zu 50 % aller Fälle negativ ist. Bei gleichzeitigem Schleimhaut- und Hautbefall steigt die Sensitivität deutlich. Im Zweifelsfall kann es hier also erforderlich sein, mehrere Biopsien zu entnehmen. Serologisch lassen sich in 30–70 % Autoantikörper gegen BP180 nachweisen (in der Hälfte aller Fälle nicht gegen die NC16A-Domäne), am zweithäufigsten gegen Laminin 332. Für den Nachweis letzterer ist eine IIF mit transfizierten Zellen mit einer Sensitivität von 84 % kommerziell verfügbar. Das Vorhandensein dieser Autoantikörper sollte bei jedem MMP dringend überprüft werden, da sie in 20–30 % aller Fälle mit einem soliden Malignom assoziiert sind und somit eine Tumorsuche empfohlen ist.

Auch bei der DHD muss die Biopsie periläsional entnommen werden, am sensitivsten ist sie im Glutealbereich. Es zeigen sich charakteristische granuläre IgA-Ablagerungen im Bereich der Papillenspitzen, seltener auch entlang der gesamten BMZ (Abb. 7). Mittels IIF am Affenösophagus lassen sich antiendomysiale Autoantikörper im Serum nachweisen. Zusätzlich können mittels ELISA auch direkt Autoantikörper vom IgA-Typ gegen die epidermale Transglutaminase nachgewiesen werden.

Die DIF kann insbesondere beim Lupus zur Bestätigung der Diagnose bzw. zur Abgrenzung von histopathologisch ähnlichen Erkrankungen (z. B. polymorphe Lichtdermatose) hilfreich sein.

Nur selten können verschiedene Arten von Kollagenosen mithilfe der DIF tatsächlich unterschieden werden, vor allem da die Muster der Ablagerungen ähnlich sind.

Die DIF kann hilfreich sein in der Diagnose einer immunkomplexmediierten Vaskulitis, insbesondere auch der Purpura Schoenlein-Henoch (PSH), erfolgt aber vor allem in Zusammenschau von Klinik und Histologie. So ist eine positive DIF nicht beweisend für eine Vaskulitis, und eine negative schließt sie nicht aus. Dies ist vor allem durch falsch-negative Resultate bei Biopsie älterer Herde zu begründen, und in möglichen falsch-positiven bei Biopsie von weit distal an den Unterschenkeln oder Füßen gelegenen Läsionen. Aus diesem Grund sollte bei Verdacht auf eine Vaskulitis eine möglichst proximal gelegene und möglichst rezent (< 24 h) aufgetretene Hautveränderung biopsiert werden.

Im positiven Fall zeigen sich bei der PSH feingranuläre Ablagerungen von IgA (manchmal mit IgM) und C3 sowie dick und diffus von Fibrinogen an den postkapillären Venolen des oberen Gefäßplexus (Abb. 9). Bei anderen Immunkomplexvaskulitiden findet sich, statt IgA, IgG und IgM [16, 17].

Insbesondere zur differenzialdiagnostischen Abklärung von mukosalen erosiven Veränderungen kann eine DIF sehr hilfreich sein. Die auch histologisch beim Lichen planus vorhandenen dyskeratotischen Keratinozyten können als sogenannte „cytoid bodies“ meistens mit Anti-IgA oder -IgM als homogen angefärbte Körper sichtbar sein, typischerweise dicht gelagert in Traubenform (dies kann ein differenzialdiagnostischer Hinweis zu anderen Erkrankungen sein, bei denen ebenfalls CB auftreten).

Daneben stellt sich die Interphasendermatitis durch eine kräftige Anfärbung der dermoepidermalen Junktionszone mit Fibrinogen dar, in Form von bandförmigen Ablagerungen mit häufig auch zotteligen, netzförmigen („shaggy“) Ausläufern in die Dermis (Abb. 10). Nachdem diese Veränderungen bei verschiedenen Erkrankungen mit Interphasendermatitis auftreten können sind sie nicht spezifisch, aber charakteristisch für den Lichen planus, und können so z. B. auch im Rahmen eines lichenoiden Arzneimittelexanthems oder einer lichenoiden GvHD zu beobachten sein. Zu beachten ist, dass einzelne „cytoid bodies“ auch in gesunder Haut vorkommen können.

Bei der Porphyria cutanea tarda, der Porpyhria variegata, der erythropoietischen Protporphyrie, aber auch bei der Pseudoporphyrie finden sich einerseits an den Gefäßen dicke, homogene Ablagerungen von IgG, manchmal auch IgA und C3. Daneben zeigen sich an der BMZ granuläre Ablagerungen von IgM und C3 sowie IgG und eventuell IgA schwach bandförmig.

In seltenen Fällen kann die DIF beim bullösen EM zur Abgrenzung gegenüber AIBD hilfreich sein, es finden sich hier häufig C3, F und selten IgM an den Gefäßen sowie C3 und F an der BMZ, außerdem „cytoid bodies“ [18, 19].

Die DIF ist insbesondere aufgrund ihrer raschen und einfachen Durchführbarkeit die Methode der Wahl zur orientierenden Diagnostik der hereditären Epidermolysis bullosa [20]. Es wird eine Biopsie von einer nicht-UV-exponierten Stelle am Rand einer Blase entnommen, wobei ein kleiner Anteil der Blase idealerweise mitgetroffen wird. So kann auch die Höhe der Spaltbildung mitbeurteilt werden. Mit Antikörpern gegen möglicherweise betroffene Strukturproteine wird ein Antigen-Mapping durchgeführt und das Färbeverhalten mit Normalhaut verglichen. Die Anwesenheit oder das Fehlen, die verminderte oder veränderte Expression von Proteinen wird dabei beurteilt. Die DIF kann auf diese Weise erste Resultate bis zum Eintreffen molekularer Untersuchungsergebnisse liefern.

Obwohl die DIF eine in ihren Grundzügen sehr alte Untersuchungstechnik ist, stellt sie nach wie vor den Goldstandard in der Diagnose einer AIBD dar. Bei zahlreichen weiteren Erkrankungen kann sie wichtige differenzialdiagnostische Hinweise geben. Die wichtigsten Grundmuster sind:

Das Ergebnis einer DIF-Untersuchung sollte immer im klinischen und histopathologischen Kontext beurteilt werden.