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Genetik 20. November 2009

Induzierte pluripotente Stammzellen

Ludwig Aigner, Salzburg

Ist der Jungbrunnen gefunden?

Oct4, Sox2, Klf4 und cMyc – auf den ersten Blick ein paar nichtssagende Abkürzungen, für den Stammzellenforscher jedoch eine magische Zauberformel, um somatische, differenzierte Zellen zu pluripotenten Stammzellen rück zu programmieren. Die beiden Japaner Takahashi und Yamanaka waren die ersten, die sich dieser Zauberformel bedienten und durch retrovirale Transfektion von Oct4, Sox2, Klf4 und cMyc Mausfibroblasten in pluripotente Stammzellen verwandeln konnten. Es sind gerade einmal drei Jahre seit dieser Meilensteinarbeit vergangen, drei Jahre, in denen wir eine regelrechte Explosion der Forschung um induzierte pluripotente Stammzellen (IPS) erlebten. Kurz nach der Erstbeschreibung der IPS-Zellen aus Mausfibroblasten konnte die Übertragbarkeit der Ergebnisse auf menschliche Zellen nachgewiesen werden. Hier war es zum einen wiederum Takahashi in der Gruppe von Yamanaka, dem es durch Gentransfer von Oct3/4, Sox2, Klf4 und cMyc gelang, aus adulten humanen Fibroblasten IPS zu generieren, zum anderen war es die Gruppe um Thomson, die durch Einbringen der Gene Oct4, Sox2, Nanog und Lin28 in humane somatische Zellen IPS-Linien herstellen konnten. Bereits zwei Jahre nach der Erstbeschreibung konnte die Anzahl der benötigten Gene von vier auf zwei reduziert werden, nämlich auf Oct4 und Klf4. Die deutsche Arbeitsgruppe um Hans Schöler erzeugte durch Einschleusen dieser beiden Gene eine embryonale Stammzell (ES)-ähnliche Pluripotenz in neuralen Stamzellen der adulten Maus. Da neurale Stammzellen ohnehin Sox2 sowie eine geringe, aber anscheinend hinreichende Menge an cMyc produzieren, reichte für die Induktion des pluripotenten Stammzellephänotyps die Expression von Oct4 und Klf4 aus.

Viele Vorteile der IPS

IPS ähneln in ihrer Ausstattung, sprich im Genexpressions- und Epigenommuster sowie in ihrer Pluripotenz den embryonalen Stammzellen. IPS erfüllten kürzlich sogar das stringenteste Kriterium für Pluripotenz, nämlich die Fähigkeit, nach Injektion in einen Blastozysten einen kompletten lebenden Organismus zu generieren. IPS haben im Vergleich zu ES-Zellen ganz wesentliche Vorteile:

 

  • Die ethisch-rechtliche Problematik, die mit dem Einsatz und der Forschung an humanen ES-Zellen in vielen Ländern verbunden ist, wird mit den IPS obsolet.
  • Die Generierung patienteneigener IPS stellt die Möglichkeit der autologen Transplantation in Aussicht. So konnten z. B. bereits IPS aus Zellen von Patienten mit amyotropher Lateralsklerose erzeugt werden. Weiterhin lassen sich in Zukunft durch die Herstellung patienten- und/oder krankheitsspezifischer IPS verschiedenste komplexe Erkrankungen vielleicht ursächlich aufklären. Zudem werden IPS in die pharmazeutische Industrie in „Drug Screening“-Projekten Einzug finden. Im Vergleich zu vielen gewebeeigenen adulten Stammzellen, wie zum Beispiel der neuralen Stammzellen aus erwachsenem Gehirngewebe, sind die zellulären Quellen für IPS, wie zum Beispiel Hautfibroblasten, natürlich leichter zugänglich und haben dadurch gewisse Vorteile.

 

Obwohl das biomedizinische Potential der IPS enorm zu sein scheint, werden wir uns bezüglich der klinischen Anwendung, insbesondere hinsichtlich der Transplantation von aus IPS gezüchteten Zellen, noch etwas gedulden müssen. Dies ist in der Tatsache begründet, dass derzeit nach wie vor die virale Transfektion der Effektoren und damit die stabile Integration dieser Gene in der IPS-Technologie dominiert. Die dadurch erzielte, zum Teil unkontrollierte Expression der pluripotent-induzierten Gene bedingt ein nicht zu vernachlässigbares Tumorrisiko. Oct4, Sox2, Klf4 und cMyc sind Gene, die in zahlreichen Tumoren exprimiert und zum Teil ursächlich in der Tumorgenese involviert sind.

Abgesehen von dem onkogenen Potential der Pluripotenz-induzierten Gene liegt eine weitere Gefahr in der retro- oder lentiviral basierten Methodik des Einschleusens der Effektorgene, nachdem die Vektoren durch die Insertion ins Genom der Zelle zusätzliche Genregulationselemente einbringen und dadurch tumorigen wirken können. Es gibt also einige ganz wesentliche methodische Belange, die vor einer klinischen Anwendung der IPS-Technologie geklärt werden müssen.

Fragen vor der klinischen Anwendung

Hierzu werden derzeit unterschiedlichste Strategien diskutiert und experimentell verfolgt:

 

  • der Einsatz von Vektoren, die nicht in das Genom der Zielzelle integrieren,
  • der Einsatz regulierbarer Expressionskonstrukte und
  • die Entwicklung von Pluripotenz-induzierbaren „small molecules“.

Als nicht-integrierende Vektoren bieten sich Replikations-defiziente adenovirale Vektoren an. Diese Vektoren haben bereits Einzug in die Klinik gefunden, wobei zu erwähnen ist, dass ein gewisses Restrisiko der Integration von adenoviralen Vektoren ins Genom nachgewiesen ist. Regulierbare Expressionskassetten werden seit Jahren in der experimentellen Forschung eingesetzt und kürzlich auch für die Herstellung von IPS-Zellen benutzt. Hier gelang die Reprogrammierung von Fibroblasten unter Verwendung eines Doxycyclin-induzierbaren Lentiviruses.

 

Die Möglichkeit, komplett auf DNA-Sequenzen bzw. auf das Einschleusen von Genen zu verzichten, ist eventuell durch den Einsatz pharmakologischer Substanzen, wie „small molecules“ gegeben. Hier sind es insbesondere epigenetisch aktive Substanzen, die durch Demethylierung, wie z. B. 5-AZA, oder durch Inhibition der Histondeacetylierung, wie z. B. Valproinsäure, Chromatin auffalten, dadurch eine Reprogrammierung erleichtern und sogar auf den Gentransfer von Oct4 und Sox2 verzichten lassen. Wobei bei der Verwendung epigenetisch aktiver Substanzen ebenfalls die eventuelle Tumorigenität in Betracht gezogen werden muss. So induziert Valproat bei Ratten z. B. Adenokarzinome im Uterus.

Fazit

Zusammenfassend scheinen die IPS-Zellen ein enormes wissenschaftliches und klinisches Potential zu haben. Sie stellen durch die Reprogrammierung adulter somatischer Zellen einen zellulären Jungbrunnen dar, wobei dieser in den nächsten Jahren sehr akribisch hinsichtlich seiner Sicherheit getestet und untersucht werden muss, um eine sintflutartige Entgleisung in Form von Tumorentstehung zu vermeiden.

Zur Person
Prof. Dr. Ludwig Aigner
Institut für Molekulare Regenerative Medizin
Paracelsus Medizinische Privatuniversität
Strubergasse 21
5020 Salzburg
Fax: ++43/662/44 2002-1223
E-Mail:

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