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Kinder- und Jugendheilkunde 16. Dezember 2013

Thymidinkinase-2-assoziiertes mitochondriales DNA-Depletionssyndrom

Erkrankung mit progredienter Muskelschwäche bei einem 2-jährigen Buben

Zusammenfassung

Mit dieser Fallpräsentation möchten wir die heutigen Möglichkeiten einer exakten Diagnosefindung bei Vorliegen einer so schwerwiegenden und für den Patienten und dessen Familie katastrophalen Erkrankung darstellen. Dies gelingt durch eine gute Zusammenarbeit zwischen den klinisch tätigen Ärzten und Spezialisten. Auch möchten wir mit der Falldarstellung einen gewissen Einblick in den großen Formenkreis mitochondrialer Erkrankungen geben. Durch die molekulargenetisch eindeutige Identifikation der ursächlichen Mutation ist grundsätzlich eine pränatale Diagnose bei weiterem Kinderwunsch möglich.

Vorgeschichte

Unser Patient ist das erste Kind gesunder Eltern, geboren am 22.12.2008. Schwangerschaft und Geburt verliefen ohne besondere Probleme. Die Mutter gab normale intrauterine Kindesbewegungen an. Muskelschwächen oder neurologische Erkrankungen waren in den Familien der Eltern nicht bekannt. Die Entwicklung des Buben im ersten Lebenshalbjahr verlief unauffällig.

Im Alter von 7–8 Monaten konnte das Kind die Sitzposition halten und begann zu robben. In der weiteren Folge kam es jedoch zum motorischen Entwicklungsstillstand bzw. zum Verlust von Fähigkeiten wie dem Robben.

Im Alter von 19 Monaten wurde das Kind dem Kinderfacharzt vorgestellt. Der Bub kann sich nicht selbständig aufsetzen, nicht aufstehen und nicht gehen. Eine Blutanalyse durch den Kinderfacharzt ergibt eine deutliche Erhöhung der Kreatinkinase (CK) mit 1800 U/l und der Laktatdehydrogenase (LDH) mit 800 U/l.

Klinischer Befund im Alter von 20 Monaten

Die erstmalige Vorstellung an unserer Abteilung erfolgte im Alter von 20 Monaten. Es präsentierte sich ein freundliches und interessiertes Kind mit normaler geistiger und sozialer Entwicklung.

Motorische Entwicklung

Das Kind konnte sich nicht selbständig aufsetzen. Passiv hingesetzt konnte das Kind die Sitzposition gut halten, mit erstaunlich gut aufgerichtetem Becken und Rumpf. Beim passiven Hinsetzen über den Seitsitz konnte der Bub den Kopf nicht halten, dieser sank zur Seite oder nach hinten. Passiv hingestellt konnte das Kind sein Körpergewicht auf den Beinen halten, dies bei durchgestreckten Kniegelenken. In der Rückenlage wurde eine geringe Bewegung der Beine beobachtet. Diese wurden abduziert und außenrotiert gehalten. Ein Anheben der Beine gegen die Schwerkraft war nicht möglich. Die in Schwebe gehaltenen Beine fielen ohne Unterstützung wieder auf die Unterlage zurück. Weiters fand sich eine deutliche Schwäche im Schulter- und Armbereich. Ein aktives Anheben der Arme (Anteversion) in der Sitzposition bis 90° war möglich. Es zeigte sich somit eine proximal betonte ausgeprägte Schwäche im Bereich der unteren, weniger deutlich, aber eindeutig auch im Bereich der oberen Extremitäten. Die Muskeleigenreflexe (Patellasehnen-, Achillessehnen- und Bizepssehnenreflex) waren nicht auslösbar.

Verdachtsdiagnose

Muskeldystrophie im Formenkreis einer Gliedergürteldystrophie

Eine Muskelbiopsie wurde vereinbart. Die Eltern scheuten diese aber und gaben an, das Kind wäre verkühlt.

Befunde im Alter von 24 Monaten

Im Alter von 24 Monaten wurde das Kind wegen eines schwerwiegenden respiratorischen Infekts als Folge einer Respiratory-syncytial-virus(RSV)-Infektion stationär aufgenommen. Die Muskelschwäche hatte weiter zugenommen. Der Knabe zeigte keine Kopfkontrolle beim Hochnehmen und eine „Froschschenkelstellung“ der Beine in Rückenlage. Den Mund hielt er offen. Zunehmende Schwierigkeiten bei der Nahrungsaufnahme und beim Sprechen waren erkennbar. Eine deutliche Schwäche zeigte sich auch im Schulter- und Armbereich. Das Kind war normal intelligent.

Relevante Befunde waren:

  • CK mit 1120 U/l (Norm: ≤ 160 U/L) und LDH mit 919 U/l (Norm: ≤ 240 U/l) deutlich erhöht, CK vom Myokardtyp (CK-MB): 149 U/l
  • Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT): 104 U/l (Norm: ≤ 43 U/l), Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT): 64 U/l (Norm: ≤ 45 U/l)
  • Plasmalaktat nur gering erhöht: 2,5 mmol/l (Norm: ≤ 2,2 mmol/l)
  • Elektrokardiogramm normal, Herzultraschall unauffällig

Muskelbiopsie im Alter von 25 Monaten

Nach Abklingen des Infekts wurde in Narkose eine offene Muskelbiopsie am Vastus lateralis des rechten M. quadriceps femoris durchgeführt. Das Biopsat wurde durch Schockgefrieren in Isopentan (− 80 °C) aufgearbeitet und in Trockeneis zur histologischen, histochemischen und immunhistochemischen Untersuchung an R. Bittner (Institut für Anatomie der Universität Wien) gesendet. Für eine etwaige elektronenoptische Untersuchung wurde ein kleines Muskelstückchen vor dem Schockgefrieren abgetrennt und in gepuffertem Glutaraldehyd (Carnovsky-Fixans) fixiert.

Befundung der Muskelbiopsie

In der HE-Färbung zeigte die Muskulatur ein dystrophisches Muster. Die Muskelfasern wiesen durchwegs pathologische Querschnittsprofile im Sinne abgerundeter Fasern auf. Weiters fand sich eine ausgeprägte Erhöhung der Variabilität der Faserdurchmesser: Es zeigten sich große hypertrophe und kleinere, hauptsächlich basophil erscheinende Muskelfasern. Immer wieder wurden Muskelfasernekrosen beobachtet. Zahlreiche Muskelfasern wiesen interne Myonuklei auf. Zu sehen waren eine massive Proliferation des peri- und endomysialen Bindegewebes und eine Einstreuung zahlreicher Fettzellgruppen ( Abb. 1 ).

Die fasertypendifferenzierenden Färbungen zeigten eine Zugehörigkeit der großen Muskelfasern ausschließlich zum Fasertyp 1. Die kleineren und kleinsten Muskelfasern wiesen häufig die Expression von Typ-2-Myosin auf.

In der Gomori-Trichromfärbung waren kleinere Muskelfasern, die in der HE-Färbung eine durchwegs basophile und grobschollig erscheinende Sarkoplasmastruktur aufwiesen, und auch zahlreiche größere Muskelfasern im Sinne von „red ragged fibers“ verändert ( Abb. 2 ).

In den oxidativen Enzymfärbungen fiel auf, dass ein Großteil der kleineren Muskelfasern praktisch keinerlei Reaktivität für die Cytochrom-c-Oxidase (COX; Komplex IV der Atmungskette) aufwies ( Abb. 3 ). Dahingegen stellten sich die COX-negativen Muskelfasern in der Succinatdehydrogenase(SDH)-Färbung (Komplex II der Atmungskette) hyperreaktiv dar.

Mit der Fragestellung „Muskeldystrophie“ wurde immunhistochemisch und mittels Western-Blots die Expression zahlreicher muskeldystrophieassoziierter Enzyme untersucht. Dabei zeigt sich eine fehlende Expression von Calpain-3. In der molekulargenetischen Untersuchung konnte aber eine Calpain-3-assoziierte Muskeldystrophie nicht bestätigt werden. Durchgeführt wurde die direkte DNA-Sequenzierung aller 24 codierenden Exons des Calpain-3-Gens. Auch konnten durch eine Mutiplex-ligation-dependent-probe-amplification(MLPA)-Untersuchung intragenische Deletionen oder Duplikationen im Calpain-3-Gen ausgeschlossen werden. Somit musste beim Patienten von einer sekundären Calpain-3-Defizienz ausgegangen werden.

Weiterführende Untersuchungen bei Verdacht auf Vorliegen einer primär mitochondrialen Erkrankung

Das Vorliegen einer primär mitochondrialen Störung war aufgrund zahlreicher „red ragged fibers“ und fehlender Reaktivität in der Cytochrome-c-Oxidase-Färbung bei einer hohen Zahl an Muskelfasern anzunehmen.

Mithilfe einer quantitativen Real-time-Polymerase-Kettenreaktion (rt-PCR) wurde die Kopienzahl des mitochondrialen Genoms im Blut und im Muskelgewebe quantifiziert ( Abb. 4 ). Die Untersuchung ergab eine ausgeprägte Reduktion der mitochondrialen DNA (mtDNA) auf 11 %, bezogen auf einen Kontrollmuskel von gesunden Erwachsenen. Im Blut fand sich dagegen keine wesentliche mtDNA-Depletion. Somit bestand der Verdacht auf das Vorliegen eines mitochondrialen DNA-Depletionssyndroms (MDS).

In einer direkten DNA-Sequenzierung aller codierenden Exons des Thymidinkinase-2(TK2)-Gens wurde schließlich eine homozygot vorliegende pathogene Mutation im Exon 6 detektiert ( Abb. 5 ). Es handelte sich um eine Missense-Mutation (c.542C > T), die den Austausch einer hochkonservierten Aminosäure (Ala 181) der Desoxyribonukleosidase-Kinase-Domäne der TK2 verursachte (p.Ala181Val).

Endgültige Diagnose

Auf molekulargenetischer Ebene konnte somit ein TK2-Gen-assoziiertes DNA-Depletionssyndrom bestätigt werden.

Diskussion

Bedeutung der Thymidinkinase

Die TK2 ist für den Aufbau der mtDNA notwendig. Der Aufbau der mtDNA unterliegt einem sog. „salvage pathway“, das bedeutet, dass die DNA in den Mitochondrien einem „Recycling“ unterliegt. Die TK2 ist für die Phosphorylierung der Nukleoside Desoxythymidin, Desoxycytidin und Desoxyuridin in den Mitochondrien erforderlich, damit diese Nukleoside wieder in die DNA eingebaut werden können. Ein TK2-Mangel führt zu einer zunehmenden Verarmung der mtDNA.

Für das TK2-assoziierte DNA-Depletionssyndrom ist typisch, dass die Entwicklung der Kinder primär unauffällig verläuft, bis der mtDNA-Pool eine gewisse Grenze unterschreitet. Bei unserem Patienten konnte eine mtDNA-Depletion im Muskel auf etwa 11 % festgestellt werden. Ein TK2-Mangel führt zu einer vorwiegend myopathischen Form eines MDS, wobei andere Gewebe mit hohem Energiebedarf wie Gehirn oder Leber weniger betroffen sind.

Andere Erkrankungen aus dem Formenkreis der MDS bewirken auch mehr oder weniger schwerwiegende Funktionsstörungen des Gehirns, der Leber und anderer Gewebe. Die Hepatoenzephalopathie als hepatische Form wird häufig durch Deoxyguanosinkinase(DGUOK)- Mutationen verursacht. Auch die Poliodystrophie (Morbus Alpers) ist ein MDS, wobei das Polymerase-γ(POLG)-Gen mutiert ist. Bei den betroffenen Patienten können die Enzyme der Atmungskette im Muskel nur eine leicht reduzierte Aktivität oder normale Aktivität zeigen, während in Gehirn und Leber eine schwerwiegendere Aktivitätsminderung besteht. Bei der enzephalomyopathischen Form der mtDNA-Depletion wurden Mutationen in den Genen SUCLA2 und SUCLG1 (Succinat-Coenzym-A-Ligase) beschrieben. Derzeit sind 9 verschiedene MDS bekannt.

Interessant ist, dass bei einem TK2-assoziierten MDS die Laktatwerte normal oder nur geringgradig erhöht sind. Ein TK2-assoziiertes MDS ist kausal nicht behandelbar und hat eine sehr ungünstige Prognose. Das Leben der Kinder ist v. a. durch eine Ateminsuffizienz im Rahmen respiratorischer Infekte gefährdet. Unser Patient ist geistig und sozial alert, aber mittlerweile völlig bewegungsunfähig, kann nicht mehr sprechen und nicht mehr essen. Daher wird er nun über eine perkutane endoskopische Gastrostomie(PEG)-Sonde ernährt.

Mitochondriale DNA

Das TK2-assoziierte MDS ist eine autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung der Mitochondrien. Bedingt ist es durch eine Mutation im nukleären Genom und nicht etwa durch eine primäre Veränderung der mtDNA. Die Mitochondrien besitzen eine eigene ringförmige DNA, die nur von der Mutter vererbt wird. Jedes Mitochondrium enthält 10–15 DNA-Moleküle, jede Zelle bis zu 10.000 mtDNA-Kopien. Auf der mtDNA liegen 37 Gene, die für 13 der insgesamt etwa 80 Proteine der Atmungskettenkomplexe I, III, IV und V codieren.

Primäre Veränderungen der mtDNA bedingen Erkrankungen wie

  • mitochondriale Enzephalomyopathie mit Laktazidose und schlaganfallähnliche Episoden (MELAS),
  • Myoklonusepilepsie mit „ragged red fibres“ (MERRF),
  • hereditäre Leber-Optikusneuroretinopathie (LHON),
  • chronisch progrediente externe Ophthalmoplegie (CPEO),
  • Kearns-Sayre-Syndrom und
  • Leigh-Syndrom.

Calpain-3-assoziierte Muskeldystrophie

Aktuell sind 7 autosomal-dominant und 11 autosomal-rezessiv vererbte Gliedergürtelmuskeldystrophien [“limb-girdle muscular dystrophies“ (LGMD)] bekannt. Die Calpain-3-assoziierte Muskeldystrophie wird autosomal-rezessiv vererbt (Chromosom 15q15.1–21.1) und als LGMD 2A klassifiziert. Die Symptome beginnen zumeist zwischen dem zweiten und 40. Lebensjahr. Die Muskelschwäche verläuft langsam progredient, wobei zumeist eine normale Lebenserwartung besteht.

Das Verteilungsmuster der Muskelschwäche bei unserem Patienten – vorwiegend am Beckengürtel, weniger ausgeprägt am Schultergürtel – dürfte aber auch mit der fehlenden Expression von Calpain 3 in der Muskulatur in Zusammenhang stehen. Eine LGMD 2A würde aber niemals einen so rasch progredienten Verlauf der Muskelschwäche bedingen.

Einhaltung ethischer Richtlinien

Interessenkonflikt. L. Rauter, R. Kerbl und R. Bittner geben an, dass kein Interessenkonflikt besteht. Dieser Beitrag beinhaltet keine Studien an Menschen oder Tieren.

Abb. 1:  HE-Färbung: Zeichen der Dystrophie

Abb. 1: HE-Färbung: Zeichen der Dystrophie

Abb. 2:  Gomori-Trichromfärbung: „ragged red fiber“ (weißer Pfeil)

Abb. 2: Gomori-Trichromfärbung: „ragged red fiber“ (weißer Pfeil)

Abb. 3:  Cytochrom-c-Oxidase(COX)/Succinatdehydrogenase(SDH)-Färbung: COX-positive Fasern stellen sich bräunlich dar. Blaue Fasern (weiße Pfeile) sind COX-negativ, sodass das blaue Reaktionsprodukt der SDH-Färbung sichtbar wird

Abb. 3: Cytochrom-c-Oxidase(COX)/Succinatdehydrogenase(SDH)-Färbung: COX-positive Fasern stellen sich bräunlich dar. Blaue Fasern (weiße Pfeile) sind COX-negativ, sodass das blaue Reaktionsprodukt der SDH-Färbung sichtbar wird

Abb. 4:  Real-time-Polymerase-Kettenreaktion (rt-PCR) der mitochondrialen DNA im Blut und Muskel

Abb. 4: Real-time-Polymerase-Kettenreaktion (rt-PCR) der mitochondrialen DNA im Blut und Muskel

Abb. 5:  Sequenzierung von Exon 6 des Thymidinkinase-2-Gens

Abb. 5: Sequenzierung von Exon 6 des Thymidinkinase-2-Gens

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