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Onkologie 9. Juni 2016

Ein vielversprechendes Werkzeug

Therapiesteuerung anhand zellfreier, zirkulierender Tumor-DNA

Durch die zunehmende Anzahl an zielgerichteten Therapien kommt es in der Behandlung von Krebserkrankungen zu einem Paradigmenwechsel. Die molekulargenetische Diagnostik und kontinuierliche Charakterisierung der Tumore gewinnt daher zunehmend an Bedeutung. In den meisten Fällen sind aber wiederholte Gewebsentnahmen eines Tumors und dessen Metastasen nicht durchführbar, weshalb eine Analyse von tumorspezifischen Veränderungen aus Blut bzw. Plasma oder Serum vorteilhaft wäre. Wiederholte Blutabnahmen sind einfach, schnell und kostengünstig zu bewerkstelligen, ohne den Patienten zu belasten. Zellfreie, zirkulierende DNA-Fragmente (ctDNA), welche von unterschiedlichen Tumorlokalisationen in die Zirkulation entlassen werden, reflektieren die Veränderungen im Tumorgenom in Echtzeit und erlauben somit eine Überwachung während des gesamten Therapieverlaufs und darüber hinaus. Unzählige Studien haben die klinische Relevanz von ctDNA als diagnostischen, prädiktiven und prognostischen Biomarker belegt. In dieser Übersichtsarbeit werden die Biologie, methodische Ansätze sowie das Potenzial der ctDNA zu Überwachung des Therapieansprechens diskutiert.

Abstract

Due to the increasing number of targeted therapies, a dramatic shift in cancer therapy has occurred. Therefore, molecular genetic diagnostics and a continuous characterization of tumors is becoming increasingly important. In most cases, however, repeated tissue sampling of a tumor and its metastases is not feasible. The analysis of tumor-specific changes from blood, i. e. plasma or serum, would be of advantage since repeated blood draws are cost-effective and easy to accomplish without burdening the patient. Cell-free circulating DNA fragments released from different tumor locations (ctDNA) reflect changes in the tumor genome in real time. Thus, ctDNA allows monitoring of the tumor genomes throughout the course of therapy and beyond. Numerous studies have already demonstrated the clinical relevance of ctDNA as a diagnostic, predictive and prognostic biomarker. In this review article, the biology, methodological approaches and the potential of ctDNA as a monitoring tool are discussed.

Einleitung

Trotz immer besserer Diagnose- und Therapiemöglichkeiten gehören Tumorerkrankungen immer noch zu den häufigsten Todesursachen beim Menschen. Tumormarker spielen hinsichtlich Diagnose, Prognose, Verlaufs- und Therapiekontrolle einer Krebserkrankung eine wichtige Rolle. Obwohl die ersten proteinbasierten Tumormarker, wie bspw. das PSA (prostataspezifisches Antigen) oder das CEA (carcinoembryonales Antigen), bereits in den frühen 60er-Jahren entdeckt und in der klinischen Routine zur Anwendung gebracht wurden, ist die Anzahl der in der Routine verwendeten Marker gering. Die meisten der heute verwendeten Tumormarker sind weder für das Vorhandensein einer bestimmten Krebserkrankung noch für eine bestimmte Tumorentität spezifisch.

Hintergrund

Die Mehrzahl der Tumormarker eignet sich daher maximal für eine Verlaufskontrolle, d. h. wie gut eine gewählte Therapiemethode anschlägt, aber nicht zur Früherkennung und Diagnosestellung von Krebserkrankungen. Auch geben Tumormarker keine Auskunft über die biologische Beschaffenheit eines Tumors bzw. dessen Evolution im Laufe der Progression, was in Zeiten der personalisierten Medizin immer mehr an Bedeutung gewinnt. Alternativ dazu kann man über Gewebebiopsien oder bildgebende Verfahren die Entwicklung eines Tumors überwachen. Aber auch diese Methoden bringen Limitationen wie fehlende Auflösung oder Belastung für die Patienten mit sich und geben kein umfassendes Bild bzw. liefern sie nur eine Momentaufnahme des Tumorgeschehens.

Durch die zunehmende Anzahl an zielgerichteten Therapien, die anhand tumorspezifischer Veränderungen bzw. aberranter Signaltransduktionswege verabreicht werden, kommt es zu einem Paradigmenwechsel in der Krebstherapie und man entfernt sich zunehmend vom „One-fits-all-Ansatz“. Gleichzeitig bedeutet dies, dass die molekulargenetische Diagnostik einen immer größeren Stellenwert zur Charakterisierung onkologischer Erkrankungen bekommt, da genetische Veränderungen – ob Mutationen, Kopienzahlveränderungen, strukturelle oder epigenetische Aberrationen – als Therapieziele herangezogen werden. Eine enge Überwachung der Tumore unter Therapie wird somit immer wichtiger, wobei die klassischen Tumormarker immer mehr an Bedeutung verlieren und von „genetischen“ bzw. „molekularbiologischen“ Markern abgelöst werden.

Die Analyse von genetischen Markern aus Körperflüssigkeiten wie Blut bzw. Plasma oder Serum erscheint vorteilhaft, da eine wiederholte Blutabnahme einfach, schnell und kostengünstig zu bewerkstelligen ist, ohne den Patienten zu belasten. Im Laufe der Tumorproliferation sterben immer wieder Tumorzellen ab, deren Genome dann in Form von DNA-Fragmenten, der sog. zirkulierenden Tumor-DNA (ctDNA), in die Blutbahn gelangen. Die Analyse der ctDNA aus dem Blut wird häufig als Flüssigbiopsie (engl. Liquid Biopsy) bezeichnet. Dabei können Veränderungen im Tumorgenom in Echtzeit während des gesamten Therapieverlaufs und darüber hinaus überwacht werden. Dadurch können klinische Ärzte sicherstellen, dass eine relevante Veränderung mit der Therapie erreicht wird und somit die verabreichte Therapie wirkt. Gleichzeitig können aufkommende Resistenzmechanismen frühzeitig erkannt werden bevor die Progression klinisch manifest wird. So könnten den Patienten unnötige Nebenwirkungen erspart bleiben, sobald sie nicht mehr von einer spezifischen Therapie profitieren. Hinzu kommt, dass im Laufe der Progression neue therapierbare Ziele aufkommen können, die ohne eine strenge Überwachung unerkannt bleiben würden. Es gibt auch Bestrebungen die ctDNA zur Früherkennung von Tumorerkrankungen und der Detektion von minimalen Resterkrankungen (MRD, „minimal residual disease“) einzusetzen. Die ctDNA findet daher ihre Verwendung als diagnostischer, prädiktiver und prognostischer Biomarker (Tab.  1 ).

Gewebe versus Blut

Die Sequenzierung von Tumorgeweben, um geeignete Therapieziele zu finden bzw. ein Ansprechen auf eine Therapie vorherzusagen, ist bereits ein zentrales Thema im Management von Tumorerkrankungen. Seit Einführung der Next-Generation-Sequencing(NGS)-Technologie wurden unzählige Tumore sequenziert und es konnte ein Bild über die genetische Vielfalt von Tumoren gewonnen werden. Ein Tumor stellt keine Einheit dar, sondern besteht vielmehr aus unterschiedlichen Subtumoren, welche alle eine Vielzahl von unterschiedlichen Mutationen und genetischen Veränderungen tragen, also ein immenses Ausmaß an Diversität aufweisen [ 1 – 3 ]. Charles Swanton und seine Gruppe haben bspw. die DNA unterschiedlicher Tumorareale verschiedener Nierentumore sequenziert und konnten eine unerwartet große genetische Vielfalt beobachten, wobei gerade mal ein Drittel der Mutationen in allen Arealen zu finden war und die meisten Mutationen spezifisch für einen bestimmten Subklon waren [ 2 ]. Um eine Therapie bestmöglich auf den Patienten bzw. dessen Tumor abzustimmen, muss ein korrektes und umfassendes molekulares Profil des Tumors erhoben werden. In vielen Fällen steht aber nur eine Gewebebiopsie für eine molekulargenetische oder immunhistochemische Analyse zur Verfügung, die nicht zwingend das gesamte Tumorgenom repräsentiert. Hinzu kommt, dass Tumore kein statisches System darstellen, sondern sich kontinuierlich weiterentwickeln und unter dem selektiven Druck von Therapien verändern. Eine Metastase, die sich Jahre nach der Diagnosestellung entwickelt, kann sich in ihrem molekularen Profil völlig vom Primärtumor unterscheiden [ 4 ]. Daher ist eine Gewebebiopsie umso unzuverlässiger, je dynamischer der Tumor sich verändert. Außerdem beinhalten Biopsien durch den invasiven Eingriff gewisse Risiken und stellen für die Patienten eine Belastung dar. Für eine Flüssigbiopsie hingegen benötigt man eine einfache Blutabnahme, die im Vergleich zur Gewebebiopsie minimalinvasiv, kostengünstig und schnell erfolgen kann. Ein weiterer Vorteil der ctDNA als Flüssigbiopsie ist die Annahme, dass zellfreie DNA von unterschiedlichen Tumorherden in die Zirkulation entlassen wird und somit als Surrogatmarker für das gesamte Tumorgenom herangezogen werden kann und daher im Vergleich zu dem Schnappschuss der Gewebebiopsie eine kontinuierliche Panoramaaufnahme liefert.

Bisher gibt es noch wenige Daten, die die Diversität von Tumoren in Zusammenhang mit dem klinischen Outcome korrelieren, daher ist es äußerst wichtig, sensitive, klinisch anwendbare Methoden zu entwickeln, mit denen es möglich ist, die Tumorheterogenität zu quantifizieren und die Dynamik von suklonalen Events in den Tumoren zu überwachen. Obwohl es bereits eine ganze Reihe von bioinformatischen Ansätzen für umfassende Analysen der Tumorheterogenität gibt [ 5 ], ist es in vielen Fällen nicht einfach, die eigentlichen Treiber der Tumorentstehung und -progression zu identifizieren. Mithilfe der Flüssigbiopsie ist es möglich, die molekulare Heterogenität von Tumoren zu bestimmen, die Tumordynamik und somit die genetische Evolution von Tumoren zu verfolgen, Therapieziele zu identifizieren und etwaige Resistenzmechanismen frühzeitig zu erkennen.

Biologie der ctNDA

Zellfreie DNA im Blut von Gesunden wurde bereits 1948 entdeckt, allerdings dauerte es Jahrzehnte bis der klinische Nutzen dieser Entdeckung erkannt wurde [ 6 ]. Erst in den 1970er-Jahren konnte gezeigt werden, dass Patienten mit einer Tumorerkrankung verglichen mit gesunden Personen erhöhte Konzentrationen an zellfreier DNA im Blut aufweisen [ 7 ]. Stroun et al. konnten 10 Jahre später erstmals tumorspezifische Veränderungen in der Zirkulation nachweisen und somit beweisen, dass die DNA-Fragmente tatsächlich von Tumoren stammten [ 8 ]. Daraufhin folgte eine Reihe von Studien, in denen unterschiedlichste tumorspezifische Veränderungen – wie Mutationen in Tumorsuppressoren und Onkogenen, Mikrosatteliteninstabilität (MSI) oder DNA Methylierung – in der Zirkulation nachgewiesen werden konnten [ 9 ].

Auch wenn es mittlerweile unzählige Studien über ctDNA und ihren klinischen Nutzen gibt, so ist immer noch wenig über den tatsächlichen Ursprung, die Mechanismen bzw. Kinetik der Freisetzung und den Abbau der ctDNA bekannt. Als Mechanismen für die Freisetzung der ctDNA werden Apoptose und Nekrose postuliert, wobei einige Studien auch auf eine aktive Sekretion hindeuten [ 10 – 13 ]. Fakt ist, dass es z. B. im Laufe der Proliferation im Tumor sowie im umgebenden Gewebe zu einer Hypoxie kommen kann, wodurch Apoptose bzw. Nekrose induziert wird [ 11 ]. Durch die Analyse der DNA-Integrität und einer Reihe von Sequenzierungsarbeiten bei Tumorpatienten, Zellkulturen und Mausmodellen weiß man mittlerweile, dass der Großteil der DNA-Fragmente in der Zirkulation von apoptotischen Zellen stammt [ 14 – 18 ]. Aus Apoptose hervorgegangene Fragmente haben eine charakteristische Länge von rund 160 Basenpaaren oder ein Mehrfaches davon, was dem Größenmuster der zellfreien, zirkulierenden DNA entspricht. Eine aktuelle Studie von Jay Shendure bestätigt apoptotische Zellen als hauptsächliche Herkunft von zellfreier DNA, da die Fragmente nukleosomale Muster widerspiegeln [ 19 ]. Anhand dieser Muster kann man auch auf die Ursprungsgewebe der zellfreien DNA und die Expression von Genen rückschließen. Entsprechend den Ergebnissen der Forschergruppe um Dennis Lo aus Hongkong erlaubt auch eine genomweite Analyse von Methylierungsmustern Rückschlüsse auf den jeweiligen Herkunftsort der einzelnen DNA-Fragmente [ 20 ]. Aus diesen beiden Studien geht hervor, dass in Gesunden ein Großteil der zirkulierenden DNA von hämatopoetischen Zellen stammt, und nur ein Bruchteil von soliden Geweben freigesetzt wird. Bei Tumorpatienten hingegen kann man den Ursprung der DNA auf das primäre Tumorgewebe und dessen Metastasen zurückverfolgen. Die Tatsache, dass auch normale Zellen, hauptsächlich jene aus dem hämatopoetischen System, DNA in die Zirkulation entlassen, ist eine jener Problematiken, die die klinische Implementierung der ctDNA verhindern bzw. verlangsamen. Die Menge der zirkulierenden DNA schwankt individuell sehr stark und kann von nahezu 100 % bei Patienten im stark fortgeschrittenen Stadium bis zu weit unter 1 % der gesamten zellfreien DNA im Blut ausmachen (Abb.  1 ). Besonders bei kleinen Tumoren in frühen Stadien kann die Menge der ctDNA trotz immer präziser werdenden Sequenzierungstechnologien unter die Nachweisgrenze fallen. In fortgeschrittenen Stadien ist die Menge an ctDNA meist ausreichend, um umfassende Analysen durchzuführen.

Die Datenlage hinsichtlich der Stabilität, dem Abbau, bzw. möglichen zirkadianen Rhythmen der zirkulierenden DNA bei Tumorpatienten ist ebenfalls noch unzureichend. Bezogen auf die Halbwertszeit weisen aktuelle Studien zur Stabilität von zirkulierender fetaler DNA bei Schwangeren auf eine Halbwertzeit von 15 min bis zu wenigen Stunden hin [ 21 , 22 ]. Ähnliches wird auch bei Tumorpatienten vermutet, wobei es durch massiven Zelltod, einem ineffizienten Abbau oder einer Kombination aus beidem zu einer Anhäufung der ctDNA kommen kann [ 23 ]. Die Tatsache, dass ctDNA in wenigen Stunden zerfällt, stellt aber gegenüber den meisten Proteinbiomarkern, die oft über Wochen im Blut verbleiben, einen Vorteil dar, da die ctDNA somit stets einen aktuellen Zustandsbericht der Tumore abliefert.

Methodische Ansätze zur ctDNA-Analyse

Die starke Fragmentierung und die relativ geringen Mengen an zirkulierender DNA stellen wohl die größten Herausforderungen in der Analyse dar. Allerdings haben sich in den letzten Jahren die molekulargenetischen Technologien immer weiter verbessert und bieten mittlerweile die nötige Sensitivität und Spezifität, um auch geringe Mengen an ctDNA in der Zirkulation nachzuweisen (Abb.  1 ).

Zielgerichtete Methoden beschränken sich auf die Analyse einzelner oder weniger, bekannter Mutation oder Hotspots. Seit den ersten zielgerichteten Mutationsanalysen in Plasma bzw. Serum in der 1990er-Jahren hat der technologische Fortschritt eine ganze Reihe von hochsensitiven Methoden wie bspw. ARMS [ 24 ], digitale PCR [ 12 , 25 ] oder BEAMing [ 26 ] mit sich gebracht, mit denen es möglich ist, Mutationen auch weit unter 1 % zu detektieren. Das heißt, dass die ctDNA auch dann noch aufgespürt werden kann, wenn das Blut 10.000-fach mehr DNA aus gesunden Zellen enthält.

Auch auf dem Gebiet des NGS wird laufend versucht die Auflösungsgrenzen zu erhöhen. So sind in den letzten Jahren unterschiedlichste Ansätze zur Anwendung gekommen: Methoden wie das TAm-Seq [ 27 ] oder CAPP-Seq [ 28 ] zielen darauf ab, eine Reihe von klinisch relevanten Genen mit möglichst großer Sensitivität zu analysieren. Ein besonders sensitiver Ansatz, der allerdings eine Verfügbarkeit des Primärtumors voraussetzt, ist die sog. „Personalized analysis of rearranged ends“ (PARE), bei der strukturelle Veränderung aus dem Primärtumor für das minimalinvasive Monitoring herangezogen werden [ 29 ].

Demgegenüber stehen genomweite Ansätze, die den großen Vorteil bieten, dass diese Methoden bei allen Patienten angewandt werden können, da sie sich nicht auf rekurrent auftretende Veränderungen beschränken und kein apriorisches Wissen über die genetische Zusammensetzung des Tumors voraussetzen [ 30 – 32 ]. Durch solche umfassend angelegten Untersuchungen können auch neu aufkommende Veränderungen in den Tumorgenomen detektiert werden, was speziell in späteren Stadien, in denen sich die Tumore unter dem selektiven Druck von Therapie oft sehr schnell entwickeln, unumgänglich ist.

Die Erstellung von genomweiten Kopienzahlprofilen aus Plasma-DNA kann mittlerweile sehr rasch und kostengünstig erfolgen [ 32 ]. Hierzugibt es eine ganze Reihe von Studien, u. a. auch von unserer Gruppe, die zeigen, dass mit solchen genomweiten Ansätzen die Evolution und die Plastizität der Tumore gut verfolgt werden kann [ 9 ]. Allerdings erfordern diese Analysen eine gewisse Menge an tumorspezifischer DNA (rund 5–10 %), was auf viele Proben von Patienten in früheren Stadien nicht zutrifft. Um Proben mit ausreichenden ctDNA-Levels zu identifizieren, haben wir eine Screeningmethode entwickelt, mit der ein Abschätzung des ctDNA-Spiegels möglich ist [ 33 ].

Klinische Anwendung der ctDNA

Die ersten Bestrebungen, die ctDNA als Biomarker zum Einsatz zu bringen, konzentrierten sich auf eine einfache Quantifizierung der DNA. Es wurde aber schnell klar, dass die Menge an zellfreier DNA alleine keinen geeigneten Marker darstellt, da die Anzahl der zirkulierenden DNA-Fragmente hoch variabel ist und teilweise mit denen von gesunden Personen überlappt [ 34 – 37 ]. Die Verwendung von tumorspezifischen Veränderungen aus der Zirkulation könnte aber in unterschiedlichen Szenarien des Therapiemanagement von Tumorpatienten zur Anwendung kommen.

Studien der Universität in Cambridge als auch der Johns Hopkins University zeigten, dass ctDNA ein weit sensitiverer Marker bei der Erfassung von Brust- und Darmkrebs ist als herkömmliche Proteinbiomarker [ 37 , 38 ]. Dawson et al. verwendeten ein personalisiertes Assay, um das Therapieansprechen bei Brustkrebspatientinnen minimalinvasiv zu überwachen. Änderungen des ctDNA-Levels korrelierten wesentlich besser mit der Tumorlast als der klassische Tumormarker CA15-3. Die Gruppe um Lao Saal aus Schweden hat sich einen kombinierten Ansatz aus einer Genomsequenzierung der Primärtumore und digitaler PCR als hochauflösende Screeningmethode zunutze gemacht, um Patientinnen mit lokalisiertem Brustkrebs über mehrere Jahre zu verfolgen und so die Rezidivrate vorherzusagen [ 39 ]. Jene Patientinnen, die nach einer kurativen Operation detektierbare Mengen an ctDNA in der Zirkulation aufwiesen, entwickelten Metastasten innerhalb einem medianen Zeitraum von 11 Monaten, während Patientinnen ohne detektierbare ctDNA ein langfristiges progressionsfreies Überleben zeigten. Ähnlich Ergebnisse erzielte die Gruppe rund um Bert Vogelstein [ 7 ]: Bereits 2007 konnten die Forscher sinkende ctDNA-Spiegel bei Unterleibskrebspatienten mit einem progressionsfreien Überleben assoziieren, während bei den Patienten mit nachweisbaren ctDNA-Spuren der Krebs nach der kurativen Operation zurückkam [ 26 ].

Ein frühzeitiges Erkennen von unterschiedlichen Resistenzmechanismen, um schnellst möglich auf neue Entwicklungen mit veränderter Behandlung reagieren zu können, kann nur durch ein enges Monitoring gewährleistet werden (Abb.  1 und  2 ). Ein Paradebespiel für den Benefit einer Flüssigbiopsie in diesem Zusammenhang ist die Therapieüberwachung von Patienten mit nichtkleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) unter Therapie mit Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKI) (Abb.  1 ). Etwa 10–15 % der Patienten mit nichtkleinzelligem Lungenkrebs tragen aktivierende genetische Veränderungen des EGFR-Gens, das für den epidermalen Wachstumsfaktor(EGF)-Rezeptor codiert – ein Protein, das an Zellwachstum und -teilung beteiligt ist und bei einer Reihe von Krebsarten pathologisch überaktiv ist. Diese Patienten profitieren von einer Therapie, welche die intrazelluläre Tyrosinkinase des modifizierten EGF-Rezeptors und damit gezielt die über diesen Rezeptor aktivierte Signalstrecke – und die damit einhergehende Tumorproliferation – blockiert. Allerdings entwickeln bis zu 50 % der Patienten, die positiv auf einen TKI ansprechen, im Verlauf der Therapie eine sekundäre Resistenz. Der zugrunde liegende Mechanismus des Wirkungsverlustes ist häufig durch eine zweite Mutation im EGFR-Gen bedingt, wodurch eine Bindungsstelle für die TKI verloren geht. Ein Monitoring dieser und anderer Resistenzmutationen kann eine Therapiesteuerung bereits vor dem klinischen Auftreten eines Rezidivs ermöglichen. Anhand von ctDNA-Analysen konnten Sorenson et al. die Reduktion der aktivierenden Mutation in 96 % der Patienten und gleichzeitig ein Aufkommen der resistenzverleihenden Mutation beobachten, und das bis zu 344 Tage bevor die Progression klinisch evident wurde [ 40 ]. Andere Studien konnten mit den unterschiedlichsten Methoden ähnliche Ergebnisse erzielen [ 41 – 43 ].

Erfolge im minimalinvasiven Tumormonitoring konnten auch bei Patienten mit kolorektalen Tumoren erzielt werden (Abb.  3 ). Ähnlich wie beim Lungenkarzinom ist der EGF-Rezeptor ein wichtiges therapeutisches Ziel in der Behandlung des metastasierten kolorektalen Karzinoms. Allerdings profitieren Patienten mit aktivierenden Mutationen im KRAS-Gen nicht von einer Behandlung mit den EGFR-Antikörpern Cetuximab und Panitumumab, da die Aktivierung des KRAS-Proteins dem EGF-Rezeptor nachgeordnet ist und es somit zu einer intrinsischen Aktivierung des Signaltransduktionsweges kommt. KRAS-Mutationen sind somit ein negativer Prädiktor für das Ansprechen auf eine EGFR-gerichtete Therapie. Aber auch jene Patienten, die initial sehr gut auf die Therapie ansprechen – also jene ohne KRAS-Mutation – entwickeln zumeist innerhalb weniger Monate Resistenzen. Bereits 2012 haben Diaz und Kollegen die Ergebnisse einer durch ctDNA-Monitoring überwachten Behandlung mit EGFR-Inhibitoren publiziert [ 44 ]. Dabei wurden resistenzverleihende KRAS-Mutationen – im Mittel 5 Monate bevor bildgebende Verfahren ein erneutes Wachstum der Tumoren belegten – detektiert. Daten unserer Gruppe belegen, dass eine umfassende genomweite Analyse der ctDNA basierend auf Kopienzahlveränderungen unter Anti-EGFR-Therapie maßgebend zur frühzeitigen Detektion von Resistenzmechanismen beitragen kann [ 45 ]. Auch in einer Reihe von Prostatakrebspatienten konnten wir Amplifikationen des Androgenrezeptorgens (AR) als Ursache einer Kastrationsresistenz nichtinvasiv nachweisen, was die klinische Relevanz von Kopienzahlveränderungen und somit auch die Notwendigkeit deren Analyse unterstreicht [ 46 ].

Die Relevanz der ctDNA wurde aber nicht nur beim Monitoring von zielgerichteten Therapien nachgewiesen. Die Sequenzierung von 15 klinisch relevanten Genen konnte den Nutzen der ctDNA als Marker für eine Therapieansprechen auf zytotoxische Chemotherapie ebenfalls bestätigen [ 47 ]. Bei mehr als 98 % der Patienten konnten Kandidatenmutationen aus dem Tumor detektiert werden, die dann mit der hochauflösenden Safe-SeqS-Methode im Plasma gescreent wurden. Patienten, die unter Chemotherapie ein signifikantes Absinken des ctDNA-Spiegels aufwiesen, zeigten ein signifikant besseres Ansprechen sowie ein besseres progressionsfreies Überleben [ 47 ]. Ein weiterer Ansatz stammt von der Gruppe um Nitzan Rosenfeld, die das gesamte Exom – also jene Abschnitte des Genoms, welche Bauanleitungen für Proteine enthalten – sequenzierten. Dabei konnten sie bei mehr als 80 % der Patienten bislang unbekannte Resistenzmechanismen aufdecken [ 48 ]. Durch die Anwendung von genomweiten Methoden wie sie von unserer Gruppe angewendet werden können sogar klonale Shifts und großflächige genetische Umbauten auf Chromosomenebene nachgewiesen werden [ 32 , 49 ]. Wir waren bspw. auch in der Lage neu entstandene Therapieziele, die im Primärtumor noch nicht vorhanden waren, in der ctDNA nachzuweisen, worauf die Therapie der betroffenen Patienten dementsprechend adaptiert wurde. Bei einem Patienten mit kolorektalem Krebs konnten wir eine Amplifikation der Rezeptortyrosinkinase FLT3 detektieren, deren Inhibitoren ursprünglich für die Behandlung von Leukämien zugelassen wurden. Ein ähnliches Beispiel kommt von einer Patientin, bei der ein Her2-negativer Brusttumor diagnostiziert wurde. In einer Plasmaprobe 5 Jahre nach der Erstdiagnose konnten wir eine fokale ERBB2-Amplifikation identifizieren, was ausschlaggebend für einen Therapiewechsel zu einem Her2-Rezeptor gerichteten Antikörper war. Die Entwicklung solcher Antikörper hat in den letzten Jahren das Überleben von Patientinnen mit Her2-positiven Brusttumoren massiv verbessert. Die Patientin sprach gut auf die Therapie an, was durch eine Regression einer neu aufgetretenen Lebermetastaste und eine Reduktion der ctDNA reflektiert wurde.

Limitationen der ctDNA

Auch wenn die Analyse der ctDNA ein großes Potenzial in sich trägt, gibt es zurzeit noch einige Vorbehalte gegen eine routinemäßige Verwendung. Viele der Ergebnisse müssen erst in groß angelegten Studien mit ausreichender Fallzahl bestätigt werden, um zu beweisen, dass die Patienten langfristig tatsächlich von ctDNA-Analysen profitieren. Die Entdeckung von Resistenzmutationen retten den Patienten weder das Leben noch erhöht es dessen Lebensqualität, solange es kein Medikament gibt, das die Resistenz umgeht oder nachfolgend verabreicht werden kann.

Zudem sind noch viele der Fragen hinsichtlich der Biologie und Freisetzung offen: Zeigt die ctDNA tatsächlich ein repräsentatives Porträt der Krebserkrankung? Setzen Tumore, die sich in andere Organe ausgebreitet haben, ebenso viel DNA frei wie der Ursprungstumor? Geben alle Zellen eines Tumors gleich viel ctDNA ab? Ist die Prävalenz der ctDNA in allen Tumorentitäten dieselbe? Dies sind Fragen, die zweifelsohne nur durch einen umfassenden Vergleich der vorhandenen Tumorlokalisationen im Rahmen von „warmen Autopsien“ geklärt werden können.

Es gibt auch noch keinen Konsens welche Methoden praxistaugliche Anwendung finden werden – beginnend bei der Präanalytik bis hin zur Auswertung und dem Reporting der Ergebnisse. Die Frage, ob man sich auf spezifische Targets, die mit hoher Auflösung untersucht werden können, fokussieren soll, oder doch einen breit angelegten Ansatz anstrebt – unter dem Vorbehalt auch nichtinterpretierbare Ergebnisse zu bekommen – scheint noch ungelöst. Hier spielen natürlich auch Kosten und Zeitaufwand eine große Rolle sowie die Frage, wer die Kosten für solche Untersuchungen übernehmen wird.

Zusammenfassung

All diese Studien und noch viele weitere, die in diesem Artikel nicht diskutiert werden konnten, legen nahe, dass die ctDNA ein äußert vielversprechendes Werkzeug im Therapiemanagement von Krebspatienten darstellt. Die bis dato umfassendste Studie von der Gruppe um Diaz zeigt, dass ctDNA bei mindestens 75 % der Patienten mit fortgeschrittenen soliden Tumoren nachweisbar ist [ 37 ]. In späteren Stadien erlaubt die Analyse der ctDNA ein umfassendes Therapiemonitoring, das es den behandelnden Ärzten erlaubt, möglichst rasch auf Veränderungen im Tumor zu reagieren und somit ihren Patienten teure Behandlungen mit teils sehr toxischen Medikamenten ab dem Augenblick zu ersparen, in dem diese ohnehin nicht mehr wirksam wären. Außerdem können neue Therapieziele, die im Laufe der Erkrankung auftreten, identifiziert werden und so dem Patienten zu neuen Therapiemöglichkeiten verhelfen. ctDNA bietet auch eine einzigartige Gelegenheit mehr über Metastasierungsprozesse und die damit verbundenen Signalwege zu erfahren.

Anhand des ctDNA-Spiegel kann auch abgelesen werden, wie erfolgreich eine Operation verlaufen ist – und ob womöglich eine Chemotherapie im Anschluss nötig ist, um noch verbliebene Krebszellen zu eliminieren. Davon profitieren könnten speziell Patienten in früheren Stadien, da nur ein Teil der Patienten nach einer kurativen Resektion des Tumors rezidiviert, während man anderen Patienten eine belastende und kostenintensive Therapie ersparen könnte.

Möglicherweise entwickelt sich die ctDNA auch zu einem diagnostischen Biomarker, der eine Früherkennung von Tumoren erlaubt. Die Firma Illumina, der momentane Marktführer auf dem Gebiet des NGS, hat Anfang dieses Jahres zusammen mit Bill Gates und Jeff Bezos (CEO Amazon) ein 100-Mio.-Dollar-Start-up-Unternehmen namens GRAIL gegründet, mit dem Ziel bis 2019 einen Test für Krebsfrüherkennung auf den Markt zu bringen. Allerdings sollte man hierbei auch bedenken, dass selbst, wenn der Präventionsgedanke in der Krebsmedizin als „der heilige Gral“ gilt, der Nachweis von spezifischen Mutationen in der Zirkulation bei Personen, die keinen oder noch keinen sichtbaren Tumor in sich tragen, problematisch sein könnte.

Einhaltung ethischer Richtlinien

Interessenkonflikt

E. Heitzer gibt an, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Dieser Beitrag beinhaltet keine Studien an Menschen oder Tieren.

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Tab. 1: Potenzielle Anwendungen der ctDNA als Flüssigbiopsie
„Companion Diagnostics“ Identifizierung/Erforschung von therapierbaren Zielen
Erforschung der Tumorheterogenität
Erforschung der Tumorevolution
Therapieüberwachung Bestimmung des Therapieansprechens
Testung auf therapierbare Ziele
Früherkennung von Resistenzmechanismen
Detektion von minimaler Resterkrankung Stratifizierung von Patienten
Bestimmung einer Remission
Früherkennung einer Progression
Früherkennung Detektion von Tumoren zum frühestmöglichen Zeitpunkt

Abb. 1:  Methodische Ansätze zur Analyse von zirkulierender Tumor-DNA. Mittels zielgerichteter Methoden können bereits sehr geringe Mengen an ctDNA nachgewiesen werden. Demgegenüber stehen genomweite Methoden, die zwar eine bestimmte Menge an ctDNA benötigen (> 5–10 %), dafür aber ein sehr umfassendes Bild der Tumoren liefern

Abb. 1: Methodische Ansätze zur Analyse von zirkulierender Tumor-DNA. Mittels zielgerichteter Methoden können bereits sehr geringe Mengen an ctDNA nachgewiesen werden. Demgegenüber stehen genomweite Methoden, die zwar eine bestimmte Menge an ctDNA benötigen (> 5–10 %), dafür aber ein sehr umfassendes Bild der Tumoren liefern

Abb. 2:  Überwachen des Therapieansprechens anhand ctDNA bei Lungenkrebs. Gezeigt ist eine schematische Darstellung eines möglichen Krankheitsverlaufes unter Anti-EGFR-Therapie aufgrund eine aktivierenden Mutation im EGFR-Gen. Gleichzeitig mit einer Tumorreduktion sinkt auch die Frequenz der aktivierenden EGFR-Mutation (orange). Aufgrund des selektiven Drucks der Therapie entsteht eine zweite resistenzverleihende Mutation (blau), die, lange bevor eine Progression klinisch evident wird, in der Zirkulation nachweisbar ist

Abb. 2: Überwachen des Therapieansprechens anhand ctDNA bei Lungenkrebs. Gezeigt ist eine schematische Darstellung eines möglichen Krankheitsverlaufes unter Anti-EGFR-Therapie aufgrund eine aktivierenden Mutation im EGFR-Gen. Gleichzeitig mit einer Tumorreduktion sinkt auch die Frequenz der aktivierenden EGFR-Mutation (orange). Aufgrund des selektiven Drucks der Therapie entsteht eine zweite resistenzverleihende Mutation (blau), die, lange bevor eine Progression klinisch evident wird, in der Zirkulation nachweisbar ist

Abb. 3:  Überwachen des Therapieansprechens anhand ctDNA bei Darmkrebs. Gezeigt ist eine schematische Darstellung eines möglichen Krankheitsverlaufes eines Darmkrebspatienten mit einem Tumor ohne KRAS-Mutation, weshalb der Patient für eine Anti-EGFR-Therapie geeignet ist. Anhand der ctDNA kann das Ansprechen auf die Therapie überwacht werden. In der ctDNA können aufkommende Resistenzmechanismen, wie bspw. Mutationen oder Amplifikationen des KRAS-Gens, frühzeitig erkannt werden, woraufhin die Therapie adaptiert werden kann

Abb. 3: Überwachen des Therapieansprechens anhand ctDNA bei Darmkrebs. Gezeigt ist eine schematische Darstellung eines möglichen Krankheitsverlaufes eines Darmkrebspatienten mit einem Tumor ohne KRAS-Mutation, weshalb der Patient für eine Anti-EGFR-Therapie geeignet ist. Anhand der ctDNA kann das Ansprechen auf die Therapie überwacht werden. In der ctDNA können aufkommende Resistenzmechanismen, wie bspw. Mutationen oder Amplifikationen des KRAS-Gens, frühzeitig erkannt werden, woraufhin die Therapie adaptiert werden kann

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