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Abb. 1: Prinzip der MALDI-TOF Massenspektrometrie. Die Analytmoleküle (z. B. Proteine, grün) bilden zusammen mit den Matrixmolekülen (gelb) Kristalle auf dem Target. Durch Laserbeschuss werden die Proteine desorbiert und ionisiert, durch ein elektrisches

Abb. 2: Massenspektrum eines Escherichia coli Stammes.

Abb. 3: Workflow der Routinediagnostik mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie.

 
Infektiologie 15. Dezember 2010

Verkürzte Analysezeit bei höherer Genauigkeit

MALDI-TOF Massenspektrometrie zur Identifizierung klinisch relevanter Mikroorganismen

Die korrekte und gleichzeitig schnelle Identifizierung von Mikroorganismen bis auf Speziesebene stellt einen der Eckpfeiler der Medizinischen Mikrobiologie dar. Zusammen mit der Resistenzbestimmung liefert sie die nötigen Informationen zur Auswahl geeigneter Antiinfektiva. Insbesondere bei schweren mikrobiellen Infektionen kann der frühzeitige Einsatz einer zielgerichteten, adäquaten Antibiotika-Therapie entscheidend zum Therapieerfolg beitragen und unter Umständen lebensrettend für den betroffenen Patienten sein. In diesen Fällen wird man nicht bis zum Vorliegen der Resistenzbestimmung warten, sondern bereits vorher mit einer empirischen antibiotischen Therapie beginnen. Eine zeitnahe Identifizierung der pathogenen Erreger kann hierzu bereits wertvolle Informationen liefern.

Anforderungen an die Erregeridentifizierung

Die klassischen Verfahren zur Erregeridentifizierung in der Medizinischen Mikrobiologie umfassen neben der mikroskopischen Darstellung zellmorphologischer Eigenschaften in erster Linie biochemische Tests, welche auf artspezifischen Wachstumsmustern und metabolischen Aktivitäten der Zellen beruhen. Die Mikroorganismen müssen hierfür zunächst angezüchtet und als Reinkultur isoliert werden, um sie gegebenenfalls von der physiologischen Flora zu trennen und genügend Zellmaterial zu erhalten. Abhängig von der Wachstumsgeschwindigkeit bzw. Generationszeit des Mikroorganismus, erfordert dies mindestens ein bis zwei Tage, kann jedoch bei langsam wachsenden Bakterien- und Pilzarten auch deutlich länger dauern. Die eigentliche biochemische Identifizierung nimmt dann in der Regel trotz weitgehender Automatisierungsmöglichkeiten nochmals einige Stunden bis mehrere Tage in Anspruch. Den Anforderungen einer schnelleren und genaueren Erregeridentifizierung kann daher nur durch den Einsatz neuer Methoden in der Laborroutine begegnet werden. Eine Möglichkeit sind molekulargenetische Methoden wie die partielle Sequenzierung der bakteriellen 16S-rDNA. Sie wird zwar in der Forschung eingesetzt, ist für einen breiten Einsatz in der Routinediagnostik jedoch zu zeitaufwändig und kostenintensiv. Eine neue, deutlich schnellere und kostengünstigere Alternative stellt die Identifizierung von Bakterien und Pilzen mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie dar, die im Folgenden vorgestellt werden soll.

MALDI-TOF MS: Ein massenspektrometrisches Verfahren zur Proteinanalytik

Unter Massenspektrometrie versteht man ein Analyseverfahren, das die Auftrennung ionisierter Teilchen nach ihrem Masse/Ladungs-Verhältnis (m/z) ermöglicht. Es geht zurück auf den britischen Physik-Nobelpreisträger J. J. Thomson, der 1912 zum ersten Mal verschiedene Neon-Isotope aufgrund ihrer Masse trennen konnte, und dessen Schüler F. W. Aston 1919 das erste funktionierende Massenspektrometer baute.

Jedes Massenspektrometer besteht aus einer Ionenquelle, die aus dem Probenmaterial gasförmige Ionen erzeugt, einem Massenanalysator, der die Ionen nach ihrem Masse/Ladungs-Quotienten auftrennt, und einem Detektor, der das Massenspektrum der untersuchten Probe liefert. Inzwischen sind verschiedene Verfahren der Massenspektrometrie entwickelt worden, die sich vor allem durch die Art der Ionisierung des jeweiligen Analyten und durch die nachfolgende Ionen-Auftrennung unterscheiden. Eines dieser Verfahren ist die sogenannte MALDI-TOF MS. Das Kürzel steht für Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight Mass Spectrometry, eine Technik zur massenspektrometrischen Auftrennung von Makromolekülen, welche 1985 von F. Hillenkamp und M. Karas entwickelt wurde. Das Besondere hierbei ist die schonende Ionisierung, bei der die Analytmoleküle nicht zerstört werden. Dadurch ermöglicht diese Methode erstmals auch die Analyse von nicht-flüchtigen Biomolekülen größerer Molekülmasse (über 20–30 kDa) wie Proteinen und Peptiden, sowie von komplexen Analytmischungen. Daher ist sie zu einer der wichtigsten Methoden in der Proteomanalytik geworden.

Die Funktionsweise eines MALDI-TOF Massenspektrometers ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt. Geringe Mengen der zu untersuchenden Moleküle oder Molekülgemische werden auf einen kleinen Probenträger (Target) aufgetragen und dort mit einem großen Überschuss der sogenannten Matrix gemischt, die zur Ionisierung der Analytmoleküle erforderlich ist. Als Matrix können verschiedene niedermolekulare, aromatische organische Säuren wie z. B. 2,5-Dihydroxy-Benzoesäure (DHB) oder α-Cyano-Hydroxyzimtsäure (CHCA) eingesetzt werden, die in der Lage sind, die Energie des eingesetzten Lasers zu absorbieren. Durch Trocknung des Matrix-Analyt-Gemisches entsteht eine kristalline Probe, in welcher die Makromoleküle des Analyten in die kleinen Matrixmoleküle eingebettet sind. Diese Probe wird im Hochvakuum des Massenspektrometers mit kurzen Laserpulsen beschossen. So werden sowohl Matrixmoleküle als auch Analytmoleküle aus der Kristalloberfläche herausgelöst und in die Gasphase überführt (Desorption). Durch Kollision der neutralen Analyt- mit den protonierten Matrixmolekülen kommt es zur Ladungsübertragung, so dass die Analytmoleküle ionisiert werden. Man bezeichnet dies als „sanfte Ionisierung“, da die komplexen Biomoleküle bei der Ionisierung nicht fragmentieren, so dass sie als intakte, meist einfach protonierte Ionen detektiert werden können. Hierzu werden sie oberhalb der Ionenquelle zunächst in einem starken elektromagnetischen Feld beschleunigt, wobei die schwereren Ionen aufgrund ihrer höheren Trägheit langsamer sind als die leichteren.

In der feldfreien Driftstrecke des langen Vakuum-Flugrohres können sie dann aufgrund ihrer unterschiedlichen Geschwindigkeiten aufgetrennt werden und erreichen den Detektor nach unterschiedlichen Flugzeiten (time-of-flight). Dort werden die auftreffenden Ionen registriert, und durch Kalibrierung des Systems mit Ionen bekannter Masse kann das Massenspektrum der detektierten Probe ermittelt werden. In Abbildung 2 ist ein typisches Massenspektrum eines Escherichia-coli-Stammes dargestellt, in dem die Masse/Ladungs-Verhältnisse (m/z) gegen die Signalintensität aufgetragen sind.

Identifizierung von Mikroorganismen: Eine neue Anwendung für die MALDI-TOF MS

In den 1990er Jahren wurde erstmals eine Messmethode für MALDI-TOF MS publiziert, welche die Analyse ganzer Zellen ohne vorherige Extraktionsschritte ermöglicht. Diese Methode kann zur Identifizierung von Mikroorganismen genutzt werden. Sie beruht auf der Tatsache, dass die Massenspektren ganzer Bakterienzellen bestimmte artspezifische und reproduzierbare Peaks aufweisen. Es handelt sich um die Massensignale kleiner, konservierter Strukturproteine, die bei Mikroorganismen relativ unabhängig vom physiologischen Status der Zelle und damit von den Kulturbedingungen in hohen Konzentrationen vorliegen. Man findet sie im Massenbereich von 2.000 bis 20.000 Dalton und geht davon aus, dass es sich überwiegend um ribosomale und andere DNA-bindende Proteine handelt. Da ihre Sequenzen hochkonserviert sind, spiegeln die messbaren Sequenz- bzw. Massenunterschiede die phylogenetischen Unterschiede zwischen Bakterienarten und -gattungen wider. Damit können sie als Biomarker zur Speziesidentifizierung genutzt werden, indem man die gemessenen Proteinspektren gegen eine Datenbank mit Referenzspektren abgleicht. Die Qualität dieser Referenz-Datenbank ist letztlich entscheidend für die Identifizierungsraten und für die Zuverlässigkeit eines solchen Systems.

Diese neue spektrometrische Identifizierungsmethode, auch ICM-MS (Intact Cell MALDI-TOF Mass Spectrometry) genannt, wurde zunächst anhand einiger gramnegativer und grampositiver Bakteriengruppen etabliert. Inzwischen sind viele Arbeiten zu diesem Thema publiziert, und es konnte für eine Vielzahl klinischer Mikroorganismen nachgewiesen werden, dass eine Identifizierung basierend auf MALDI-TOF Massenspektren möglich ist. Beispiele sind Staphylokokken, Streptokokken, Nonfermenter, Enterobacteriaceae, aber auch mit konventionellen Methoden schwieriger zu identifizierende bakterielle Spezies wie Anaerobier, Mykobakterien, Bacillus-Sporen, Helicobacter und Campylobacter, Mykoplasmen, Legionellen und weitere Gattungen. Auch Hefen, Dermatophyten und Schimmelpilze können mittels MALDI-TOF MS identifiziert werden, was die Routinediagnostik von Pilzinfektionen erheblich verkürzt und erleichtert.

Das Messprinzip ist für alle Gruppen von Mikroorganismen gleich: Eine geringe Menge Zellmaterial wird von der Kulturplatte auf ein MALDI-Target übertragen, dort mit der Matrixlösung gemischt und nach dem Auskristallisieren im Massenspektrometer analysiert. Auch Flüssignährmedien können abzentrifugiert und die Zellpellets aufgetragen werden. In der Regel erfolgt dies ohne eine Vorbehandlung des Zellmaterials. Lediglich bei Hefen und Schimmelpilzen, deren Zellwand schlechter aufzuschließen ist als die bakterielle Zellwand, kann eine vorherige Extraktion der Zellen in geeigneten Lösungsmitteln oder eine Vorbehandlung mit Formiat nötig sein, um eine ausreichende Qualität der Spektren zu erzielen.

Einsatz im Routinelabor: Verbesserung von Workflow und Diagnosezeiten

Die wesentlichen Voraussetzungen für den Einsatz einer solchen Methode in der Diagnostik eines Routinelabors sind: Eine einfache Probenvorbereitung, kurze Messzeiten bis zum Ergebnis, eine automatisierbare Abarbeitung großer Probenmengen und natürlich eine breit aufgestellte, gut gepflegte Referenzdatenbank zum Abgleich der gemessenen Spektren. Wichtig ist, dass die Datenbank nicht nur Spektren altbekannter Typstämme, sondern vor allem die Variabilität aktueller klinischer Isolate innerhalb einer Bakterienspezies abbildet. Ebenso wichtig ist ein Algorithmus, der im Zuge des Datenbankabgleiches entweder ganze Spektren oder gewichtete Peaks innerhalb der Spektren miteinander vergleicht und die Ergebnisvalidität mittels eines Wahrscheinlichkeitswertes angeben kann, wie er auch bei konventionellen Identifizierungssystemen üblich ist.

Diese Anforderungen werden inzwischen von mehreren kommerziellen Systemen verschiedener Firmen erfüllt. Als erste brachte die Firma AnagnosTec, ein Spin-Off-Unternehmen der TU Berlin, im Jahre 2000 ihre Auswertungssoftware und Datenbank SARAMISTM (Spectral Archiving and Microbial Identification System) auf den Markt. Sie wurde bisher mit den AXIMA-Massenspektrometern der Firma Shimadzu als AXIMA@SARAMISTM-System vertrieben, zukünftig wird die Firma bioMérieux dieses System als Vitek MSTM anbieten. 2004 folgte die Firma Bruker Daltonics mit dem MALDI BioTyperTM-System, das mit verschiedenen Bruker-Massenspektrometern genutzt werden kann. Obwohl anfänglich durchaus mit Skepsis aufgenommen, so haben sich beide Systeme inzwischen im Routineeinsatz bewährt und werden in vielen Laboratorien zur Erregeridentifizierung eingesetzt.

Einer der großen Vorteile ist die geringe Menge an Zellmaterial, die zur Messung benötigt wird. Schon eine einzeln liegende, stecknadelkopfgroße Kolonie auf einem Nährboden liefert genügend Zellmaterial zur Analyse. Dadurch ist es möglich, eine Identifizierung mittels MALDI-TOF MS bereits von der Primärplatte des Kulturansatzes durchzuführen, auch wenn diese eine Mischkultur mehrerer Keime enthält. Bei schnell wachsenden Bakterien kann daher bereits weniger als 24 Stunden nach dem Probeneingang im Labor eine Identifizierung der Erreger erfolgen.

Ein weiterer Vorteil ist die Geschwindigkeit der Messung selbst. Die Analyse einer Einzelprobe dauert weniger als eine Minute, abhängig davon, wie schnell die nötige Anzahl Mess-Spektren mit den vorgegebenen Qualitätskriterien aufgenommen wird. Inklusive der Probenvorbereitung benötigt die Identifizierung eines Isolats somit nur wenige Minuten, was die Diagnosezeiten im Labor erheblich verkürzt.

Abbildung 3 zeigt den Workflow bei der Diagnostik mittels MALDI-TOF MS. Das Zellmaterial wird in der Regel mit einer sterilen Pipettenspitze von einer Kolonie auf der Agarplatte entnommen und ohne weitere Vorbehandlung auf einen Spot auf dem Probenträger aufgebracht. Auch Extrakte von Pilzen oder schwer aufschließbaren Bakterienzellen können innerhalb weniger Minuten vorbereitet und auf das Target pipettiert werden. Auf dem Target werden die Zellen mit einer kleinen Menge (0,5–1 µl) der Matrixlösung gemischt, wodurch sie abgetötet und aufgebrochen werden, so dass die Kokristallisation von Matrix und Zellproteinen erfolgen kann. Diese Probenvorbereitung kann an der Laborbank erfolgen und ist damit bereits abgeschlossen. Das Target wird in die Vakuumkammer des Massenspektrometers eingeschleust und dort gemessen, wobei ein Referenzstamm mit bekanntem Massenspektrum zur Kalibrierung des Systems und zur Qualitätskontrolle dient. Die erhaltenen Massenspektren der untersuchten Proben werden von der Analysesoftware mit der Referenzdatenbank abgeglichen und die Identifizierungsergebnisse ausgegeben.

Die beiden oben beschriebenen Software-Systeme SARAMIS bzw. MALDI-BioTyper erlauben die gleichzeitige Vorbereitung und automatische Messung größerer Probenmengen. Über entsprechende Client-Server-Lösungen können die Proben in großen Laboratorien an mehreren Arbeitsplätzen dezentral präpariert und die entsprechenden Probenlisten zur Abarbeitung in das Massenspektrometer geladen werden. So ist gewährleistet, dass die Probendaten zu jedem Messpunkt korrekt zugeordnet werden. Bei den AXIMA-Massenspektrometern der Firma Shimadzu wird der Workflow im Labor zudem dadurch begünstigt, dass bis zu vier Targets mit jeweils 48 Probenspots gleichzeitig präpariert und gemeinsam in das Gerät geladen werden können, wo sie nacheinander gemessen werden.

Die Analysesoftware der MALDI-TOF MS Systeme gibt die Identifizierungsergebnisse wie bei den konventionellen biochemischen Systemen mit einem Konfidenzwert aus, der die Qualität der Identifizierung bewertet. Gemäß vom Anwender festgelegter Kriterien wird entschieden, welche Ergebnisse direkt an das Laborinformationssystem (LIS) übermittelt werden können und welche zunächst validiert werden müssen. Über das LIS können die MALDI-TOF-Ergebnisse auch an automatisierte Systeme zur Resistenztestung weitergegeben werden. Dort wird die Spezies-ID benötigt, um über das jeweilige Expertensystem eine Interpretation der Resistenzbestimmung vornehmen zu können. Um diese Anbindung zu erleichtern, entwickeln verschiedene Hersteller integrative Plattformen, bei denen die Ergebnisse von MALDI-TOF MS und Resistenzbestimmung direkt in einer Software-Plattform zusammengeführt werden, dort validiert werden können und schließlich an das LIS übergeben werden.

Validierung und Akkreditierung: Implementierung eines MALDI-TOF MS Systems im Routinelabor

Neben Schnelligkeit und einfachem Handling sind Verlässlichkeit, Robustheit und Reproduzierbarkeit einer Identifizierungsmethode entscheidende Voraussetzungen für ihren Einsatz im Routinelabor. Viele Studien bescheinigen den MALDI-TOF MS Systemen inzwischen im Vergleich mit konventionellen biochemischen Systemen eine größere Genauigkeit bei ähnlich hohen Identifizierungsraten.

In unserem medizinisch-mikrobiologischen Routinelabor haben wir uns relativ früh entschlossen, ein MALDI-TOF MS basiertes Identifizierungssystem im Hinblick auf Praxistauglichkeit, Robustheit und Leistungsfähigkeit zu testen. Wichtig war uns dabei nicht nur eine sinnvolle Integration in den Workflow unseres Labors, um eine zeit- und kostensparende Diagnostik anbieten zu können, sondern auch die Akkreditierbarkeit des Systems durch die DACH (Deutsche Akkreditierungsstelle Chemie GmbH). Unsere Wahl fiel auf das AXIMA@SARAMIS System der Anbieter Shimadzu und AnagnosTec, so dass im Herbst 2007 das erste Massenspektrometer in unserem Labor aufgestellt werden konnte. In einer anfänglichen Familiarisierungsphase wurden Probenvorbereitung und Umgang mit Gerät und Software erlernt. Die Einarbeitungszeit neuer Mitarbeiter in die Routinehandhabung ist relativ kurz: Innerhalb von einer bis zwei Wochen kann die Erstellung reproduzierbarer guter Probenspots sowie die Bedienung von Gerät und Software erlernt werden.

In einer längeren Validierungsphase wurde das System dann in unserem Labor evaluiert und auf die geplante Akkreditierung vorbereitet. In Zusammenarbeit mit der Firma AnagnosTec wurden zunächst die Leistungsparameter festgelegt und die Robustheit des Systems ermittelt. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine verlässliche Identifizierung verschiedener Referenz- und Ringversuchsstämme nahezu unabhängig von den eingesetzten Nährmedien und Wachstumsbedingungen erfolgt. Somit ist es möglich, die zu identifizierenden Mikroorganismen jeweils unter den für sie idealen Wachstumsbedingungen anzuzüchten. Auch die technischen Parameter wie beispielsweise die aufgetragene Zellzahl, die Lagerungsdauer der fertig präparierten Proben und die Zahl der Laserpulse pro Probe können innerhalb einer relativ großen Spannbreite variiert werden. Positiv fiel auf, dass außerhalb der idealen Messparameter nahezu keine Fehlidentifizierungen, sondern lediglich Identifizierungen mit niedrigeren Wahrscheinlichkeitswerten oder ohne Ergebnis auftraten.

Nach Festlegung der Messparameter wurden Vergleichsstudien mit unseren etablierten biochemischen Identifizierungssystemen durchgeführt, um die diagnostische Leistung des MALDI-TOF-Systems beurteilen zu können. Hierzu nutzten wir klinische Stämme, die in unserer Laborroutine aus Patientenmaterial isoliert wurden. Tabelle 1 gibt einen Überblick über die Resultate.

In einer ersten Studie testeten wir 816 Isolate aus der Familie der Enterobacteriaceae, die zunächst mittels konventioneller biochemischer Methoden (PhoenixTM der Firma Becton Dickinson bzw. MicronautTM der Firma Merlin Diagnostika) identifiziert worden waren. Um ein möglichst breites Spektrum auch selten auftretender Spezies erfassen zu können und eine zu große Redundanz häufig auftretender Arten zu vermeiden, wurde ein Schema zur Auswahl der Stämme erarbeitet. Übereinstimmende Ergebnisse beider Identifizierungssysteme wurden bei 686 Stämmen (84,1 %) erzielt, während die Ergebnisse bei 46 Stämmen (5,6 %) differierten. Wiederholungsmessungen und Sequenzierungen zeigten, dass die biochemischen Methoden in 45 Fällen (5,5 %) falsche Identifizierungen geliefert hatten, während das MALDI-TOF-System nur in einem einzigen Fall (0,12 %) ein falsches Ergebnis brachte. Die Fehlerrate dieses neuen Systems liegt also deutlich niedriger als die der konventionellen Systeme. Demgegenüber steht, dass wir mit dem MALDI-TOF-System nur bei 732 Stämmen ein Identifizierungsergebnis erhielten, was einer Identifizierungsrate von 89,7 % entspricht. Hier zeigt sich ein genereller Unterschied des MALDI-TOF-Systems im Vergleich zu biochemischen Methoden. Während letztere im Falle gemischter Kulturen oder schlechter Probenvorbereitung oft ein falsches biochemisches Muster und damit ein falsches Ergebnis liefern, erhält man für solche Fälle im MALDI-TOF-System in der Regel keine Identifizierung, wodurch die Fehlerrate entsprechend niedriger liegt.

In einer zweiten Studie führten wir Vergleichsmessungen mit einem breiteren Keimspektrum durch, das u. a. Staphylokokken, Enterokokken, Nonfermenter, Haemophili und Neisserien beinhaltete. Anhand von 240 Stämmen aus 31 verschiedenen Non-Enterobacteriaceae-Spezies wurden die Ergebnisse unseres MALDI-TOF-Systems durch Re-Identifizierung mittels unserer etablierten biochemischen Methoden überprüft. 89,2 Prozent der Ergebnisse stimmten überein. Die Diskrepanzen waren in dieser Studie auf 9,6 Prozent Falschidentifizierungen der konventionellen Systeme zurückzuführen, während das MALDI-TOF-System keine falschen Ergebnisse ausgab (1,2 % der Fälle waren auch nach Sequenzierung nicht eindeutig klärbar).

Da unsere Studien dem MALDI-TOF MS System eine sehr hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Identifizierungsergebnisse bescheinigten, entschieden wir nach der Validierungsphase, dieses System als Haupt-Identifizierungssystem in unsere Laborroutine zu integrieren. Dort ersetzt es inzwischen die meisten der konventionellen Identifizierungssysteme für Bakterien und Pilze. Im März 2009 erhielt unser AXIMA@SARAMIS-System als erstes MALDI-TOFSystem die Akkreditierung nach DIN EN ISO 15189 durch die DACH GmbH, die uns damit die hohe Kompetenz und Qualität dieser Analysetechnik bescheinigte. Inzwischen ist diese Akkreditierung in vielen weiteren Laboratorien erfolgt.

In unserem Labor hat die Implementierung des neuen Systems zu einer deutlichen Vereinfachung und Straffung der Arbeitsabläufe geführt, da die Vorbehandlung und Präparation der Proben sehr schnell durchführbar und zudem für alle Keimgruppen gleich ist. Gleichzeitig konnten wir die Analysezeiten bei der Keimidentifizierung von 24 Stunden auf wenige Stunden verkürzen, so dass eine Weitergabe der Ergebnisse an die Einsender noch am gleichen Tag erfolgen kann. Mit der ständigen Erweiterung der Datenbank sind unsere Identifizierungsraten inzwischen deutlich über 90 Prozent gestiegen.

Ausblick: Weitere diagnostische Anwendungen der Identifizierung mittels MALDI-TOF MS

Neben der Analyse mikrobieller Kulturen von festen Nährböden ist die direkte Identifizierung von Keimen aus bewachsenen Blutkulturen ein weiteres, zunehmend wichtiges Einsatzgebiet der MALDI-TOF-Technologie. Hierbei wird Zellmaterial aus bewachsenen Blutkulturflaschen abzentrifugiert, gereinigt und zur Analyse auf das MALDI-Target aufgetragen. Auch wenn die Identifizierungsraten naturgemäß niedriger liegen als bei Proben von Kulturplatten und zudem durch geringe Zelldichten oder Mischkulturen limitiert werden, so ist es doch in ca. 80 Prozent der Fälle möglich, bereits wenige Stunden nach der Positivmeldung einer Blutkulturflasche ein Resultat zu erhalten. Somit kann das Identifizierungsergebnis bei Sepsis-Patienten einen Tag früher als bei konventioneller Anzucht der Bakterien vorliegen, was eine schnellere und damit möglicherweise entscheidende Anpassung der antibiotischen Therapie ermöglicht. Ähnliche Methoden werden zurzeit für eine Bakterienidentifizierung direkt aus Urinproben entwickelt.

In jedem Fall ist allerdings eine grundsätzliche Limitierung der Methode zu bedenken: Sie beschränkt sich auf die Speziesbestimmung. Die Antibiotika-Resistenzbestimmung, ein unverzichtbarer Bestandteil der medizinisch-mikrobiologischen Diagnostik, muss nach wie vor mit konventionellen Verfahren durchgeführt werden. Hierbei können Routinelabors jedoch von der oben beschriebenen Anbindung des MALDI-TOF-Systems an etablierte automatisierte Systeme zur Resistenztestung profitieren. Interessant für Laboratorien mit hohem Probendurchsatz ist zudem die automatisierte MALDI-Probenvorbereitung, die im Zuge des Trends zur mikrobiologischen Laborautomatisierung realisiert wurde.

Betrachtet man die rasante Entwicklung, die von Manchen auch als „Revolution der Keimidentifizierung“ bezeichnet wird, so ist zu erwarten, dass sich das Einsatzspektrum für die MALDI-TOF Massenspektrometrie in der mikrobiologischen Diagnostik noch deutlich erweitern wird. Zukünftige Applikationen, die zurzeit bereits etabliert werden, sind beispielsweise die Analyse von Mischkulturen, die Identifizierung von Subspezies, sowie die Typisierung verschiedener MRSA-Stämme und anderer Nosokomialkeime zur schnelleren Analyse von Ausbruchssituationen. Daneben gibt es zahlreiche weitere, teilweise noch etwas exotisch anmutende Anwendungsmöglichkeiten: In mehreren Studien konnte die Identifizierung eukaryotischer Einzeller wie Plasmodien, Cryptosporidien und Giardien mittels MALDI-TOF MS durchgeführt werden. Auch Cyanobakterien und einige Algen können identifiziert werden, ebenso Vielzeller wie pflanzenschädigende Nematoden, bestimmte Blattläuse und Bartmücken (Gnitzen). Schließlich kann die Technik zur Untersuchung bakterieller Biofilme oder zur Identifizierung von Zelllinien im Zellkulturlabor eingesetzt werden.

Fazit

Die Identifizierung von Mikroorganismen mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie bietet dem medizinisch-mikrobiologischen Labor eine Methode mit deutlich verkürzter Analysezeit bei gleichzeitig höherer Genauigkeit gegenüber den konventionellen Systemen. Diese Technik hat daher das Potential, die klassischen biochemischen Identifizierungsverfahren in weiten Bereichen abzulösen, wie das in einigen großen Laboratorien bereits erfolgt ist.

 

Literatur bei der Autorin

Tabelle 1 Vergleichsstudien unseres MALDI-TOF MS Systems mit konventionellen biochemischen Identifizierungssystemen
 Übereinstimmende ID beider SystemeInkorrekte ID der biochem. SystemeInkorrekte ID des MALDI-SystemsKeine ID der biochem. SystemeKeine ID des MALDI-SystemsID nicht eindeutig klärbar
Studie 1: Enterobacteriaceae (816 Stämme aus 41 Spezies) 84,1 % 5,5 % 0,1 % Entfällt bei Studie 1 10,3 %
Studie 2: Weitere Bakteriengruppen (240 Stämme aus 31 Spezies) 89,2 % 9,6 % 0,0 % 0,0 % Entfällt bei Studie 2 1,2 %

S. Burak, A. Gehrt1, Wiener Klinisches Magazin 6/2010

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