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Allgemeinmedizin 18. April 2013

Plastizität der WNT-Signalwegaktivität im Kolonkarzinom

Zusammenfassung

Obwohl sich bei den meisten Kolonkarzinomen inaktivierende APC-Mutationen finden, zeigen diese Tumoren häufig eine heterogene Expression des WNT-Effektorproteins β-Catenin. Starke Expression im Zellkern findet sich hier oftmals nur an der Invasionsfront des Tumors. WNT-Reporterkonstrukte können verwendet werden, um solche Tumorzellen mit hoher WNT/β-Catenin-Aktivität, die gleichzeitig hohe Mengen putativer Tumorstammzellmarker exprimieren, aus den Karzinomen zu isolieren. Werden solche Tumorzellen jedoch in Xenotransplantationsexperimente eingesetzt, zeigen diese erstaunlicherweise keine wesentlich erhöhte Tumorigenität. Hohe WNT/β-Catenin-Aktivität ist also nicht generell mit Tumorstammzelleigenschaften gleichzusetzen. Stattdessen scheint die WNT/β-Catenin-Aktivität im Kolonkarzinom plastisch zu sein, da sowohl Tumorzellen mit hoher als auch mit niedriger WNT/β-Catenin-Aktivität neue Tumoren ausbilden können, die wiederum beide Populationen enthalten. Zudem kann die WNT/β-Catenin-Aktivität über den MAPK-Signalweg moduliert werden, was aufzeigt, wie andere Signalwege zur Plastizität der WNT-Signalwegaktivität im Kolonkarzinom beitragen können.

Abstract

Despite inactivating APC mutations, colorectal cancers express the WNT-effector protein β-catenin in a heterogeneous pattern, with strong nuclear expression confined to a fraction of tumor cells, often only at the tumor’s leading edge. WNT-reporter constructs allow separation of these tumor cells with highest WNT/β-Catenin activity, which also express high levels of several putative cancer stem cell antigens. Unexpectedly however, these cells do not show exclusive tumorigenicity in xenograft experiments, thus questioning their general stemness phenotype. Instead, there appears to be significant plasticity between both tumor cells with high and low WNT/β-Catenin activity because both cell types can form tumors which again show mixed populations. Furthermore, WNT/β-Catenin activity in colon cancer cells can be modulated by MAPK signaling thus revealing a means of how other signaling pathways contribute to WNT signaling plasticity in colon cancer.

Inaktivierende APC-Mutationen, die zu einer Dysregulation des WNT-Signalwegs führen, finden sich bei den meisten Kolonkarzinomen. Interessanterweise sind putative Stammzellmarker im Kolonkarzinom häufig WNT-Zielgene. Im Folgenden soll der Zusammenhang zwischen WNT-Signalwegaktivität und putativen Tumorstammzelleigenschaften beim Kolonkarzinom dargestellt werden.

WNT in der Normalschleimhaut und im Kolonkarzinom

Normales Dickdarmepithel bildet mit seinen Krypten stereotypische Einheiten aus, mit einem Stammzellkompartiment an der Kryptenbasis und reiferen Epithelzellen zum Kryptenapex hin [ 1 , 2 ]. Epithelzellen im Stammzellkompartiment zeigen eine erhöhte kanonische WNT-Signalwegaktivität [ 3 ], mit vermindertem Abbau des WNT-Effektors β-Catenin, welches im Kern zusammen mit TCF und LEF die Transkription von WNT-Zielgenen reguliert, unter diesen einige putative Stammzellantigene [ 4 , 5 ]. Reiferen Epithelzellen, die in der Krypte mehr apikal liegen, fehlt dagegen dieser WNT-Stimulus. Hier wird β-Catenin durch einen Komplex aus APC, Axin und GSK3β abgebaut und steht daher nicht mehr als Transkriptionsfaktor im Zellkern zur Verfügung, mit folglich verminderter WNT-Zielgenexpression [ 6 ].

Nun finden sich in den meisten Kolonkarzinomen inaktivierende Mutationen im APC-Gen, mit der Folge, dass der Abbau von β-Catenin über den APC/Axin/GSK3β-Komplex in den Tumorzellen beeinträchtigt ist [ 7 , 8 ]. Obwohl dies impliziert, dass sich in allen Epithelzellen eines Kolokarzinoms mit solch einer APC-Mutation eine starke Anreicherung von β-Catenin in den Zellkernen finden müsste, ist dies in den Tumoren so nicht zu beobachten. Immunhistologisch zeigt sich, dass nur ein eher kleiner Teil der Tumorzellen, typischerweise nahe der Invasionsfront, stark β-Catenin in den Zellkernen exprimiert [ 9 , 10 ]. Diese Zellen wirken morphologisch oft weniger gut differenziert mit Ausbildung kleiner Tumorknospen und kleinerer Drüsenverbände. Mehr zentral im Karzinom gelegene Tumorzellen zeigen dagegen weniger oder kein nachweisbares nukleäres β-Catenin, morphologisch reifen die Tumorepithelien hier vermehrt mit größeren Drüsenformationen aus. Aus diesen Beobachtungen ergeben sich zwei wesentliche Fragestellungen:

  • Haben Tumorzellen mit starkem nukleärem β-Catenin, die morphologisch eher weniger reif erscheinen, Tumorstammzelleigenschaften?
  • Wodurch kommt die heterogene Verteilung von β-Catenin im Kolonkarzinom trotz inaktivierender APC-Mutationen zustande?

WNT und Kolonkarzinomstammzellen

Der aktuelle Goldstandard, um Tumorzellen auf Stammzelleigenschaften hin zu untersuchen, sind Xenotransplantationsexperimente. Karzinomzellen werden dann Stammzelleigenschaften zugeschrieben, wenn sie in der Lage sind, nach Transplantation in eine immunkompromittierte Maus einen neuen, dem Ursprungstumor morphologisch gleichenden Tumor auszubilden [ 11 ]. Interessanterweise sind Marker für solche tumorinitiierenden Zellen beim Kolonkarzinom, wie CD133 [ 12 ] oder CD44 [ 13 ], WNT/β-Catenin-Zielgene [ 4 , 5 ], sodass die Vermutung naheliegt, nukleäres β-Catenin und hohe WNT-Aktivität markiere in diesen Tumoren die Stammzellpopulation.

Um Tumorzellen mit hoher WNT/β-Catenin-Aktivität in Kolonkarzinomen zu markieren und für Untersuchungen auf Stammzelleigenschaften zu extrahieren, eignen sich TOP-GFP („green fluorescent protein“) -basierte lentivirale Konstrukte, die hohe WNT-Aktivität über grüne Fluoreszenz in den Tumorzellen anzeigen ( Abb. 1 , [ 14 , 15 ]). GFP-positive Tumorzellen mit hoher WNT/β-Catenin-Aktivität können dann aus transduzierten Tumorxenotransplantaten per fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) extrahiert werden. Erwartungsgemäß zeigen solche Tumorzellen eine erhöhte Expression von WNT/β-Catenin-Zielgenen und putativen (Tumor-)Stammzellmarkern wie z. B. CD133, CD44 oder auch LGR5 [ 15 , 16 ].

Werden von verschiedenen Kolonkarzinomxenotransplantaten aus Zelllinien und primären Kolonkarzinomen WNT/β-Catenin-aktive, also GFP-positive Tumorzellen auf ihre tumorinitiierenden Eigenschaften hin untersucht, ergeben sich jedoch inkonsistente und teils widersprüchliche Ergebnisse. In unserer Studie fand sich unter 5 Tumoren nur ein einziger, bei dem WNT/β-Catenin-aktive Tumorzellen eine mäßig erhöhte Tumorigenität und somit putative Stammzelleigenschaften aufwiesen [ 16 ]. In den übrigen Fällen zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen Tumorzellen mit hoher oder niedriger GFP-Fluoreszenz und somit hoher bzw. niedriger WNT/β-Catenin-Aktivität. Unsere Ergebnisse widerlegen daher die Annahme, hohe WNT-Aktivität und nukleäres β-Catenin seien generelle Marker für tumorinitiierende Stammzellen des Kolonkarzinoms [ 15 ].

Ein möglicher Erklärungsansatz für diese Beobachtung wäre, dass zwischen Tumorzellen mit hoher und niedriger WNT/β-Catenin-Aktivität eine gewisse Plastizität besteht. In der Tat können beide Tumorzellpopulationen offenbar ineinander übergehen, was sich mittels FACS-Analyse der Tumorxenotransplantate auch zeigen lässt ( Abb. 2 ). TOP-GFP-transduzierte Kolonkarzinome, die per FACS in relativ reine GFP-positive und -negative Populationen, also Populationen mit hoher und niedriger WNT/β-Catenin-Aktivität, aufgetrennt werden, formen jeweils neue Xenotransplantattumoren, die wiederum beide Populationen enthalten. Verschiedene Tumorzellsubpopulationen – inklusive putativer Tumorstammzellen – bilden daher möglicherweise ein Gleichgewicht in den Tumoren aus und sind demnach in ihrem Phänotyp offenbar plastischer als dies nach dem derzeitigen Tumorstammzellmodell angenommen wird.

MAPK-Regulation

Ungeachtet putativer Tumorstammzelleigenschaften scheinen Kolonkarzinomzellen mit hoher WNT/β-Catenin-Aktivität klinisch relevant zu sein. Diese Tumorzellen finden sich häufig in randständigen, infiltrativen Tumorabschnitten und ihre Anzahl und Verteilung ist möglicherweise mit dem Überleben von Patienten assoziiert [ 17 , 18 ]. Was ist also die Ursache für dieses sog. β-Catenin-Paradoxon [ 19 ], der heterogenen WNT/β-Catenin-Aktivierung in Kolonkarzinomen mit APC-Mutationen? Untersuchungen an Zebrafischen haben gezeigt, dass APC-Inaktivierung alleine offenbar nicht ausreicht, um β-Catenin im Epithelzellkern zu akkumulieren, sondern, dass zusätzlich aktivierende Mutationen in K-RAS und somit eine Aktivierung des MAPK-Signalwegs vorliegen müssen [ 20 ]. Es ist also möglich, dass die heterogene WNT/β-Catenin-Aktivität im Kolonkarzinom über den MAPK-Signalweg mit reguliert wird.

In der Tat findet sich in den meisten Kolonkarzinomen eine heterogene Aktivierung des MAPK-Signalwegs. Dass aktivierter MAPK- und WNT-Signalweg in Kolonkarzinomzellen zusammenhängen, lässt sich mit verschiedenen Untersuchungen auf zunächst korrelativer Ebene zeigen [ 16 ]: Tumorzellen mit hoher MAPK-Aktivität haben gleichzeitig hohe WNT-Aktivität, was sich immunhistologisch als Koexpression von phosphoryliertem ERK und nukleärem β-Catenin in denselben Tumorzellen darstellt. Auf Genexpressionsebene bestätigt sich dies, da sich in WNT/β-Catenin-positiven Kolonkarziomzellen, die mittels TOP-GFP markiert und per FACS extrahiert wurden, eine hochsignifikante Überexpression von MAPK-Zielgenen findet. Des Weiteren sind aktivierende K-RAS-Mutationen und somit konstitutiv erhöhte MAPK-Signalwegaktivität in Kolonkarzinomkollektiven mit einer vermehrten Anzahl von WNT/β-Catenin-positiven Tumorzellen assoziiert. Lässt sich also die WNT/β-Catenin-Signalwegaktivität über den MAPK-Signalweg regulieren? Zwei experimentelle Ansätze legen nahe, dass hohe MAPK-Aktivität und hohe WNT/β-Catenin-Aktivität in Kolonkarzinomzellen nicht nur kolokalisieren, sondern MAPK tatsächlich den WNT-Signalweg beeinflusst. Werden Xenotransplantattumoren von Kolonkarzinomen mit mutiertem, konstitutiv aktivem K-RAS G12V transduziert, so exprimieren in den transduzierten Tumoranteilen nun alle Zellen stark nukleäres β-Catenin und zeigen erhöhte Expression von WNT/β-Catenin-Zielgenen. Eine Blockade der EGF-Rezeptoren über Behandlung der Tumorxenotransplantate mit Cetuximab führt neben verminderter MAPK-Aktivität auch zu einer deutlichen Reduktion WNT/β-Catenin-aktiver Tumorzellen [ 16 ].

Diese Experimente zeigen, dass der MAPK-Signalweg in Kolonkarzinomsubpopulationen nicht nur mit dem WNT-Signalweg koaktiv ist, sondern diesen auch direkt regulieren kann und somit für die Plastizität der WNT-Signalwegaktivität im Kolonkarzinom mit verantwortlich ist. Detaillierte Kenntnisse über die molekularen Mechanismen derartiger Interaktionen [ 21 , 22 ] könnten letztlich zur gezielten und effektiven Kombination verschiedener Signalweginhibitoren bei der Therapie des Kolonkarzinoms beitragen.

Fazit für die Praxis

In Kolonkarzinomen finden sich typischerweise Tumorzellen mit hoher und mit niedriger WNT-Aktivität. Hohe WNT-Signalwegaktivität ist allerdings für sich genommen kein zuverlässiger Marker für Kolonkarzinomstammzellen. Vielmehr ist die WNT-Aktivität in Kolonkarzinomzellen offenbar plastisch und wird durch andere Signalwege, wie MAPK, moduliert. Für die Therapie des Kolonkarzinoms sind daher möglicherweise kombinierte medikamentöse Ansätze sinnvoll, die solche synergistisch wirkenden Signalwege gleichzeitig gezielt blockieren.

Danksagung

Ich danke insbesondere meinen klinisch-pathologischen und wissenschaftlichen Mentoren Herrn Prof. Dr. Thomas Kirchner, Herrn Prof. Dr. Andreas Jung und Herrn Prof. Dr. Ramesh Shivdasani für die umfassende Unterstützung meiner Arbeiten. Der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) danke ich für die finanzielle Förderung im Rahmen eines Forschungsstipendiums.

Interessenkonflikt

Der korrespondierende Autor gibt an, dass kein Interessenkonflikt besteht.

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Abb. 1:  In Kolonkarzinomen finden sich Tumorzellen mit hoher WNT-Aktivität und nukleärem β-Catenin häufig an der Invasionsfront (links, braune Zellkerne). Diese Zellen sind morphologisch oft weniger gut drüsig differenziert und haben möglicherweise Stammzelleigenschaften. Mit lentiviralen TOP-GFP-Vektoren können Tumorzellen mit hoher WNT/β-Catenin-Aktivität markiert werden (rechts, grüne Zellen). Tumorzellen mit geringer WNT/β-Catenin-Aktivität zeigen dagegen wenig oder fehlende grüne Fluoreszenz (rechts, graue Zellen)

Abb. 1: In Kolonkarzinomen finden sich Tumorzellen mit hoher WNT-Aktivität und nukleärem β-Catenin häufig an der Invasionsfront (links, braune Zellkerne). Diese Zellen sind morphologisch oft weniger gut drüsig differenziert und haben möglicherweise Stammzelleigenschaften. Mit lentiviralen TOP-GFP-Vektoren können Tumorzellen mit hoher WNT/β-Catenin-Aktivität markiert werden (rechts, grüne Zellen). Tumorzellen mit geringer WNT/β-Catenin-Aktivität zeigen dagegen wenig oder fehlende grüne Fluoreszenz (rechts, graue Zellen)

Abb. 2:  Plastizität der WNT/β-Catenin-Aktivität in Tumorzellpopulationen. TOP-GFP-transduzierte Kolonkarzinome zeigen eine gemischte Population aus Tumorzellen mit hoher und niedriger GFP-Fluoreszenz (links). Mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung können diese in relativ reine GFP-positive und GFP-negative Subpopulationen aufgetrennt und in immunkompromittierte Mäuse implantiert werden (Mitte). Nach Xenotransplantation können beide Subpopulationen Tumoren ausbilden, die jeweils wiederum eine Mischung aus GFP-positiven und -negativen Tumorzellen enthalten (rechts). SSC Seitwärtsstreulicht

Abb. 2: Plastizität der WNT/β-Catenin-Aktivität in Tumorzellpopulationen. TOP-GFP-transduzierte Kolonkarzinome zeigen eine gemischte Population aus Tumorzellen mit hoher und niedriger GFP-Fluoreszenz (links). Mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung können diese in relativ reine GFP-positive und GFP-negative Subpopulationen aufgetrennt und in immunkompromittierte Mäuse implantiert werden (Mitte). Nach Xenotransplantation können beide Subpopulationen Tumoren ausbilden, die jeweils wiederum eine Mischung aus GFP-positiven und -negativen Tumorzellen enthalten (rechts). SSC Seitwärtsstreulicht

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